Яблоко по клеткам: Рисунки по клеточкам «Яблоко»

Содержание

Яблоко по клеточкам в тетради

Рисование по клеточкам фрукты

Рисунки по клеточкам

Вышивка крестиком Вишенки

Легкая вышивка крестом фрукты

Рисунки по клеткам

Рисование по клеткам

Рисунки по клеточкам

Рисунки по клеточкам в тетради

Красивые рисунки вклкточку

Цветное рисование по клеткам

Рисование по клеточкам в тетради

Рисование по клеткам

Рисование по клеточкам фрукты

Рисования поклеточком

Рисование по клеткам

Рисование пакльточкам

Р̆̈й̈с̆̈ў̈н̆̈о̆̈к̆̈ п̆̈о̆̈ к̆̈л̆̈ӗ̈т̆̈о̆̈ч̆̈к̆̈ӑ̈м̆̈

Рисунки по клеточкам маленькие

Рисунки по клеточкам фрукты

Рисование по клеткам

Рисунки по клеточкам легкие

Рисование по клеточкам овощи

Рисунки по клеточкам

Крутые рисунки по клеточкам в тетради

Рисунки по клеточкам для начинающих лёгкие

Рисование по клеточкам сладости

Пиксельный Арбуз

Рисование по клеточкам еда

Рисунки по клеточкам маленькие крутые для 10 скрыпыши

Эппл по клеточкам

Цветы по клеточкам в тетради

Рисование по клеточкам логотипы

Рисунки в клеточку

Рисунки по клеточкам

Рисунки по клеточкам лёгкие

Геометрические фигуры по клеткам

Рисование по клеточкам маленькие рисунки

Рисование по клеткам Божью коровку

Пони по клеточкам

Рисунки по клеткам цветные

Рисование по клеточкам маленькие и легкие и милые

Рисунки по клеточкам лёгкие

Рисование поклеточкам фруктв

Рисование по клеточкам дерево

Красивые рисунки по клеткам

Яблоко по клеточкам

Рисование пакльточкам

Цветное рисование по клеткам

Рисование по клеточкаv

Вишня крестиком

Легкая вышивка крестом фрукты

Рисование пакльточкам

Рисование по клеткам легкие

Рисование по клеточкам фрукты

Рисунки по клеточкам фрукты

Рисование по клеточкам айфон

Рисунки по клеточкам в тетради

Рисунки по клеточкам легкие

Рисование по клеточкам фрукты

Цветное рисование по клеткам

Рисунки по клеточкам в тетради

Рисование пакльточкам

Рисунки по клеточкам pixellenger

Рисунки по клеткам маленькие красивые милые и легкие

Пиксельный Арбуз

Рисование по клеточкам в тетради

Рисунки по клеточкам маленькие крутые для 10 скрыпыши

Рисование по клеточкам логотипы

Логотипы по клеточкам

Рисунки по клеточкам Киксы

МЛП пиксель арт

Рисование по клеточкам маленькие рисунки

Пиксельные рисунки

Вышивка по клеточкам лёгкие

Легкая вышивка крестиком

Рисование по клеточкам цветы

Рисование по клеткам для мальчиков

Рисунки по клеточкам в тетради для начинающих

Рисунки в клетку майнкрафт

Рисунки по клеткам цветные

Рисование по клеточкам фрукты

Нутелла по клеткам

Пиксельные листочки для пиксель арта

Рисунки по клеточкам значки

Рисунки по клеточкам без чёрного цвета

Рисунки в клеточку

Рисунки по клеточкам

Рисование по клеточкам фрукты и ягоды

Рисунки по клеточкам маленькие

Рисоаниепор клеточкам

Вещи по клеточкам

Рисование по клеточкам овощи

Рисунки по клеточкам минекрафт

По клеточкам сладкое

Рисование по клеточкам птицы

Рисование пакльточкам

Минни Маус по клеточкам маленькие

Рисование по клеткам

Рисунки в клеточку

Новогодние рисунки по клеточкам маленькие

Рисование по клеткам

Крестик рисунок

Мини рисунки по клеточкам

Вышивка крестиком клубника

Р̆̈й̈с̆̈ў̈н̆̈о̆̈к̆̈ п̆̈о̆̈ к̆̈л̆̈ӗ̈т̆̈о̆̈ч̆̈к̆̈ӑ̈м̆̈

Идеи для рисунков по клеточкам

Рисунки в клеточку

Рисование по клеточкам сладости

Рисование по клето/Кам

Косметика по клеточкам

Рисование по клеточкам новый год

Рисование по клеточкам в тетрадке

Сердечко по клеточкам в тетради

По клеточкам

Рисование по клеточкам любовь

Рисование по клеточкам еда

Идеи для рисунков по клеточкам

Рисунки по клеточкам

Рисунки в клеточку

Рисунки по клеточкам для начинающих лёгкие

Красивые рисунки по клеткам

Рисунки по клеткам в тетради

Рисунки по клеткам логотипы

Рисование по клеткам

Гравити Фолз вышивка крестиком

Рисование по клеточкам картинки

Клетки для рисования

Планета по клеточкам

Рисование по клеточкам принцессы

Сердце по клеточкам в тетради

Рисунки по клеточкам

Мороженое по клеткам

Рисунки по клеткам Пикачу

Рисование по клеточкам еду

Пиксельные картинки

Пиксель арт в тетради

Рисунки по клеточкам мелкие

Рисование по клеточкам губы

Фруктовая чай Турецкое Яблоко 500 гр (артикул W-413)

Кусочки сочных яблок и спелого ананаса, листья ежевики — и вот, необычный коктейль вкусов уже готов. Оригинален также вид сухой желто-оранжевой смеси с зелеными штрихами. Как вы представляете себе фрукты из далеких турецких берегов? Притягательными и экзотическими. Именно поэтому чай с восточным названием, источающий восхитительный аромат спелого манго, вобрал в себя вкус яблока в сочетании со сладостью ананаса. А листья ежевики завершают композицию, добавляя ей большей целостности. Хоть оттенок напитка неяркий, но это не мешает раскрыть спектр вкусовых оттенков, а приятное тепло каждого глотка буквально разливается по клеточкам тела, поднимая настроение и согревая душу. Состав: кусочки яблока, кусочки ананаса, листья ежевики, аромат спелого манго.

Количество чая: 2 чайные ложки. Объем и температура воды: 450 мл, 90-95 С. Время заваривания: 5 минут.

Курьерская доставка по Москве и ближайшим районам за МКАД (до 10км):

Срок 1-3 рабочих дня; стоимость 300₽ для заказов до 2500₽ и свыше 2500₽ бесплатно.

Интервалы доставки по Москве: с 09:00 до 13:00, с 13:00 до 16:00, с 16:00 до 19:00, с 19:00 до 22:00, с 10:00 до 18:00; по Москве в выходные и праздничные дни: с 10:00 до 14:00, с 14:00 до 18:00, с 10:00 до 18:00; по Московской области (до 10 км от МКАД): с 10:00 до 22:00, с 10:00 до 14:00, с 14:00 до 18:00; по Московской области (до 10 км от МКАД) в выходные и праздничные дни: с 10:00 до 22:00.

Курьерская доставка по Санкт-Петербургу в пределах КАД:

Срок 2-3 рабочих дня; стоимость 350₽ для заказов до 2500₽ и свыше 2500₽ — 100₽.

Интервалы доставки: с 10:00 до 15:00, с 15:00 до 18:00, с 16:00 до 19:00, с 17:00 до 20:00, с 18:00 до 21:00, с 19:00 до 22:00.

Доставка в пункты выдачи заказов (ПВЗ) Москвы:

СДЭК: стоимость 200₽ для заказов до 2500₽ и свыше 2500₽ бесплатно; оплата при получении возможна для заказов от 1000₽; передача на доставку на 2-3 рабочий день.

Доставка в пункты выдачи заказов (ПВЗ) Санкт-Петербурга:

СДЭК: стоимость 250₽ для заказов до 2500₽ и свыше 2500₽ — 100₽; оплата при получении возможна для заказов от 1000₽; передача на доставку на 2-3 рабочий день.

Доставка в другие населенные пункты РФ, Казахстан и Республику Беларусь:

Стоимость зависит от населенного пункта и веса; оплата при получении возможна для СДЭК для РФ для заказов от 1000₽; передача на доставку на 2-3 рабочий день.

Бонусная программа: регистрация в личном кабинете — 20 баллов; покупка — 50₽ от заказа 1 балл.

Написать отзыв

Необходимо войти или зарегистрироваться перед тем, как написать отзыв

Узнаем что можно нарисовать в Паинте, инструменты и цвета

Paint — это стандартный для Windows графический редактор. И хотя он не может похвастаться широким функционалом, зато с ним очень легко работать. Эта программа позволяет создавать простые рисунки и вносить небольшие правки в фото или изображение. Давайте же рассмотрим, что можно нарисовать в «Паинте».

Инструменты Paint

«Паинт» обладает довольно ограниченным набором возможностей, однако с ними все равно стоит ознакомиться, прежде чем приступать к рисованию.

После запуска программы все доступные инструменты вы найдете на верхней панели. Всего вам доступны две вкладки: «Главная» и «Вид». В главной вкладке есть такие группы инструментов:

«Буфер обмена» — содержит стандартные возможности вставить, вырезать и копировать изображение или его фрагмент.
«Изображение» — позволяет выделить, повернуть и поменять размер рисунка или фотографии.
«Инструменты» — содержит небольшой набор кистей и набор стандартных инструментов для рисования.
«Фигуры» — дает возможность добавить фигуру, изменить цвет ее заливки и контура, выбрать толщину линии.
«Цвета» — позволяет выбрать цвет линий и заливки.

Во вкладке «Вид» вы имеете возможность приблизить или отдалить изображение, включить линейку, сетку и отображение строки состояния, а также развернуть рисунок во весь экран.

Как рисовать в Paint

Рисовать в «Паинте» можно как используя карандаш или кисти, так и с помощью фигур. Чтобы нарисовать контур, нужно выбрать карандаш или понравившуюся кисть и провести линию, зажав клавишу мыши.

Если вы хотите добавить фигуру, то просто нажмите на интересующий вас объект из имеющихся шаблонов, поместите курсор на холст и потяните в желаемом направлении. Фигуру можно переместить и сменить ее размер. Также можно изменить цвет ее контура и заливки. За оттенок контура отвечает «Цвет 1» на панели инструментов, а за оттенок заливки — «Цвет 2». В качестве заливки или контура для объекта можно применить текстуру одной из имеющихся кистей.

Что можно нарисовать в «Паинте» для начинающих?

Если вы впервые рисуете на компьютере, то попробуйте изобразить что-то простое с помощью шаблонных фигур. Например, простейшее здание, состоящее из прямоугольника, треугольника и нескольких квадратов. Также можно изобразить «смайлик» с помощью круга и линий.

Нарисовать в «Паинте» можно что угодно, все зависит от вашей фантазии. Конечно рисунки, созданные в Paint, далеки от профессиональных картин, но вполне подойдут в качестве простых иллюстраций.

Как нарисовать замок в Paint

Дом или простой человечек — это не единственное, что легко и красиво можно нарисовать в «Паинт». Например, в этой программе вы можете изобразить целый замок. Для этого нарисуйте с помощью фигур три прямоугольника. Центральная фигура должна быть ниже остальных.

Добавьте сверху каждого прямоугольника по три зубца. Для этого можно использовать фигуру «Прямоугольник» или нарисовать зубцы карандашом. Таким образом у вас получится три башенки. На высоких башнях рисуем окна с помощью скругленных прямоугольников. На центральной башне добавляем ворота, и проводим на них несколько линий.

По бокам можно дорисовать зубчатые стены и дорогу перед воротами, используя фигуру «Линия». Закончив рисовать контур, используйте заливку, чтобы быстро и легко покрасить рисунок.

Как можно нарисовать дерево

Если вам интересно, что легкое можно нарисовать в «Паинте», попробуйте нарисовать дерево. А изобразить его можно разными способами. Например, красивое дерево получится из фигур «Выноска-облако» и «Треугольник», надо только вытереть несколько лишних элементов ластиком. Также дерево можно нарисовать из нескольких кругов и прямоугольника.

Из трех треугольников и квадрата получится аккуратная елочка. Можно сделать более простой вариант, используя только один треугольник.

Пейзаж

Если вас интересует, что красивое можно нарисовать В «Паинте», то попробуйте изобразить различные пейзажи, используя в рисунке все те же фигуры или рисуя линии кистью. Например, можно нарисовать горы с помощью треугольников, несколько небольших деревьев или елок и овальное озеро посередине. Также можно сделать ночное небо с помощью звезд и темно-синей заливки.

Животные

Помимо всего прочего, в «Паинте» можно нарисовать разнообразных животных из геометрических фигур. К примеру, можно изобразить лису из четырех треугольников разного размера, пары кругов и фигуры «Молния».

Чтобы нарисовать кота можно использовать треугольники для тела, ушей и хвоста, круг для головы и ромбы для глаз. А для изображения медведя понадобятся только круги и овалы разного размера.

Что можно нарисовать в «Паинте» по клеткам

Благодаря функции «Включить сетку», рисовать в «Паинте» по клеткам довольно легко. Нарисовать можно любую интересующую картинку, следуя инструкции или схеме.

Например, попробуем нарисовать яблоко. Для этого сначала нужно перейти на вкладку «Вид» в «Паинте» и включить «Линии сетки», а затем снова вернуться на главную вкладку. Чтобы рисовать было немного проще, можно максимально приблизить лист и рисовать с помощью карандаша, а потом при необходимости увеличить картинку.

Переходим на главную вкладку, выбираем зеленый цвет и закрашиваем три клеточки. После этого отступаем семь клеток вправо и закрашиваем еще три клеточки. Возвращаемся к первым трем клеткам, опускаем карандаш на один квадрат вниз влево и закрашиваем горизонтально пять клеточек. Опять опускаемся вниз и влево на один сектор и закрашиваем шесть клеток. Теперь под шестью клеточками закрашиваем пять клеток, а затем ниже еще три. На этом первый листочек яблока будет готов, для второго листочка справа повторяем зеркально те же действия.

Нарисовав оба листочка, выбираем коричневый цвет, отступаем две клетки от верхней части левого листочка и рисуем вертикальную линию на пять клеточек вниз. Через центр этой линии закрашиваем еще пять клеточек по горизонтали, соединяя два зеленых листа. Снизу коричневой вертикальной линии закрашиваем еще одну клетку вправо, затем ведем карандаш вниз на одну клеточку, снова вправо и вниз.

Теперь приступаем к рисованию контура самого яблока и выбираем черный цвет. Под веткой с листьями закрашиваем черным три клетки по горизонтали.

Перемещаем карандаш на одну клетку вправо вверх и закрашиваем еще три горизонтальные ячейки. Чуть ниже справа зарисовываем две клеточки по горизонтали, а затем еще одну по диагонали вниз. После этого еще правее рисуем линию на две клетки вниз, опускаемся на одну клетку по диагонали вниз и закрашиваем еще пять ячеек вертикально.

Переносим карандаш на одну клетку вниз и влево и закрашиваем вертикально два квадрата. Ниже повторяем это действие. Зарисовываем диагонально вниз еще две ячейки. Опускаемся ниже на одну клеточку и закрашиваем три горизонтальных квадрата влево. Затем зарисовываем один квадрат влево вверх и еще выше две клеточки по горизонтали. Таким образом у вас получиться половина контура. Вторую половину рисуем как будто она отражена в зеркале. При необходимости можно свериться с изображением выше.

Закончив рисовать контур, используйте инструмент «Заливка», чтобы покрасить яблоко в нужный цвет.

python — Я чайник и решил написать змейку

Дружище, в строках

xapple = int
yapple = int

не указываешь, что xapple и yapple это целочисленные значения, а передаёшь в эти названия классы. В питоне не как в сиподобных языках, тут не нужно указывать тип переменной.

А вот оператор == это не оператор присваивания, а оператор сравнения. Он будет выводить только True или False, поэтому функции

def randomAppleXcor():

    xapple == random.randrange(-600, 600)

def randomAppleYcor():
    yapple == random.randrange(-500,500)

будут просто передавать значения False и уходить эти значения будут в никуда. Тебе нужно исправить == на = и убрать

 xapple = int
yapple = int

Также тебе нужно объявить xapple и yapple любое значение, но, пусть это будет 0 и 0, так как мы используем целочисленное значение. А также в питоне, что было внутри функции, остаётся внутри функции помимо return и global (ну и ещё несколько). Поэтому мы пишем

global xapple

global yapple

в соответствующих функциях, чтобы питон работал именно с основными переменными, а только внутри функции.

Также я бы заменил в твоём случае на random.randint(), вместо random.randrange(), ибо, думаю, у тебя они будут по клеточкам двигаться. Также, у тебя (-600, 600) и (-500, 500) — большой слишком размах. Экран не такой большой. Я указал (-10, 10) и (-10, 10), в итоге стало видно. Просто подбирай значения теперь и всё будет супер.

В итоге получится:

import turtle, random

apple = turtle.Turtle()
apple.shape('circle')
apple.color('red')
apple.penup()
apple.speed(0)

xapple = 0
yapple = 0

def randomAppleXcor():
    global xapple
    xapple = random.randint(-10, 10)

def randomAppleYcor():
    global yapple
    yapple = random.randint(-10,10)


randomAppleXcor()
randomAppleYcor()

apple.goto(xapple, yapple)

P.s. извиняюсь за такое большое количество правок, просто каждый раз нахожу всё новое и новое

Урок по информатике во 2-м классе «Алгоритм»

Цели:

Ввести понятие «алгоритм»;
Научить составлению и выполнению алгоритма;
Научить поиску ошибок и исправлению алгоритма.

Ход урока:

1. Организационный момент.

Оздоровительная минутка «Сотвори солнце в себе».

— Ребята в природе есть солнце. Оно всем светит и всех любит. Давайте сотворим солнце в себе.

Сядьте удобно, возьмитесь за руки, закройте глаза. Представьте в своем сердце маленькую звездочку. Мысленно направляем к ней лучик, который несет любовь. Звездочка увеличилась. Направляем лучик, который несет мир. Звездочка опять увеличилась. Направляем лучик с добром. Звездочка стала еще больше. Я направляю к звездочке лучики, которые несут здоровье, радость, тепло, нежность, ласку. Теперь звездочка стала большой, как солнце. Оно несет тепло всем-всем. Улыбнитесь друг другу и пожелайте успехов на уроке.

Сегодня солнышко и к нам заглянуло. Посмотрите, какое оно ласковое, приветливое. А кому оно особенно улыбнется, вы узнаете в конце урока.

Каждому, кто будет хорошо работать на уроке, солнышко подарит свою эмблему.

2. Сообщение темы и целей.

Мы продолжаем наше путешествие по удивительной стране Информатике. Тема нашего урока — «Алгоритм». Перед нами стоит большая проблема:

Как составлять и выполнять алгоритм?
Как находить ошибки в алгоритме и исправлять их?
И что же такое алгоритм?

Ребята сегодня перед уроками мы с вами встретились в школе и сказали друг другу: «Доброе утро».

А как же оно начиналось, наше «доброе утро»?

Эти рисунки перепутаны, но их легко можно разместить по порядку.

Вспомните последовательность выполнения своих действий утром (один ученик выполняет задание у доски). Вы поставили картинки в нужном порядке и показали, в какой последовательности выполняли свои действия утром. Это и есть алгоритм «доброго утра».

Вы пошли в школу, но многим из вас нужно переходить дорогу, вспомните последовательность ваших действий при переходе дороги.

Ответ детей:

Подхожу к зебре.
Смотрю налево.
Если машин нет, иду до середины дороги.
Останавливаюсь и смотрю направо.
Если машин нет, перехожу дорогу.

Вывод: вы составили алгоритм перехода дороги.

Так что же такое алгоритм?

Может кто-то из вас скажет?

Прочитайте, как в учебнике дается понятие алгоритма.

Дети читают определения: Последовательность действий программы называется алгоритмом.

3. Работа по учебнику (стр. 15, задание 29).

Кто это к нам стучится? Из какой сказки герой пришел к нам на урок?

Ответы детей: Буратино из сказки «Золотой ключик».

Буратино: «Ребята помогите мне правильно закопать золотые монеты на «Поле чудес».

А помогут нам в этом команды из задания №29. Назовите команды по порядку. Ответы детей:

Выкопай ямку.
Положи в ямку деньги.
Полей водой.
Засыпь ямку землей.
Скажи: «Крекс, фекс, пекс».
Засыпь ямку землей.
Стоп.

Молодцы, правильно составили алгоритм. (Буратино прощается и уходит)

А у нас еще не все проблемы решены на уроке.

Вот еще один сказочный персонаж. Кто это? (Незнайка)

Он хочет съесть яблоко и не знает, как это сделать. Поможем ему. Составьте алгоритм «съешь яблоко». (Команды закрыты, учитель открывает их после ответов детей)

Правильно составили алгоритм. Теперь Незнайка может съесть свое яблоко.

А мы на странице 16 выполняем задание №31 самостоятельно. Для ребят среднего ряда индивидуальное задание: включить плейер и выполнить все команды (например, возьми синий карандаш, нарисуй воздушный шарик, раскрась его, положи карандаш на место, стоп).

Проверка самостоятельной работы.

Прочитайте, какие действия вам нужно было выполнить.

Ответы детей:

Возьми ручку.
Напиши слово «мама».
Положи ручку на место.
Стоп.

Все выполнили задание правильно. Молодцы! Ребята, вы написали такое дорогое слово «мама». А знаете ли вы свою маму? Приходит мама с работы, а вы загляните ей в глаза, посмотрите какие они: веселые или грустные, уставшие, озабоченные. Может ваша мама, замерзла? Согрейте ее. Приготовьте заварку и приготовьте маму чаем.

Составим алгоритм, как правильно приготовить заварку.

Каков же порядок заваривания чая?

Здесь опять все перепутано. В каком порядке нужно выполнять действия, запишите.

Я думаю, что мама попьет чай, и ее глаза станут веселыми. А вы для мамы станете добрым волшебником.

4. Чтение стихотворения.

«Стать добрым волшебником».

Стать добрым волшебником
Ну-ка попробуй,
Здесь хитрости, в общем,
Не нужно особой.
Понять и исполнить желанье другого-
Одно удовольствие, честное слово.
На клумбе цветок, его листья повисли,
Грустит он о чем, угадай его мысли.
Он хочет напиться, эй дождик полей-
И дождик струится из лейки твоей.
А что же сестренка скучает в сторонке?
Волшебное что-нибудь сделай сестренке-
И ты обернулся ретивым конем,
Галопом сестренка помчалась на нем.
Хоть мама еще не вернулась с работы,
Не трудно узнать ее думы, заботы.
Вернусь — хорошо бы пошить, почитать,
Да надо с уборкой возиться опять.
И ты совершаешь великое чудо-
Ковер засиял, засверкала посуда.
И ахнула мама, вернувшись домой-
Да это как в сказке, волшебник ты мой.

5. Физкультминутка.

Вы, наверное, немножко устали?

А вот существует такое мнение, что если у человека прямая спина, прямой ровный позвоночник, то в таком состоянии он получает заряд энергии из космоса. Человек становится здоровее, мудрее, счастливее.

Встаньте, выпрямите свои спинки, улыбнитесь, вытяните руки вверх. Представьте, что вы крепкое, сильное деревце. Высокий стройный ствол тянется к солнцу. Ваш организм, как дерево, наливается силой, бодростью, здоровьем. Опустите руки и расслабьтесь.

А теперь, когда вы взяли энергию из космоса, продолжаем нашу работу.

6. Диктант по клеточкам.

Выполни действия:

Возьми карандаш.
Напиши диктант по клеточкам.
Дорисуй полученный рисунок.
Положи карандаш на место.
Стоп.

У вас должен получиться вот такой рисунок.

Что это? (Робот) Что вы знаете о роботах?

Это машина, она выполняет заданную человеком программу.

7. Игра «Робот».

Ребята, давайте поиграем.

Я на время становлюсь роботом. Вы будете подавать четкие правильные команды роботу. Попросите робота съесть конфету, которая лежит у меня на столе. Задавайте по одной команде, а робот их будет выполнять. Дети задают команды:

Возьми конфету.
Разверни конфету.
Съешь конфету.
Выброси фантик в мусорное ведро.
Стоп.

Посмотрите, а правильно ли Карлсон ест конфету? Есть ли ошибки в алгоритме? Если есть, исправьте их.

Дети отвечают:
Лишняя команда — вымой конфету.

Ребята, а какую команду забыла выполнить Красная Шапочка, когда ставила цветы в вазу?
Ответ детей: Налей воды.

8. Обобщение.

Мы с вами учились составлять алгоритм, находить и исправлять ошибки в алгоритме. Так что же такое алгоритм? (Ответы детей)

Догадываетесь ли вы, ребята, что мы пользуемся алгоритмом на каждом уроке математики? Вот вам математическое задание: «Выполни действие в этой программе».

Это при решении примеров. У каждого из вас есть памятка решения задач. Это тоже алгоритм. Повторим последовательность выполнения действий при решении задач (Дети читают хором памятку).

Алгоритм мы применяем везде: и дома в быту, и в школе на уроках математики и русского языка (при решении орфографических задач).

Посмотрите, как ребята составили алгоритм развития лягушки и бабочки в природе. Алгоритм развития лягушки:

Икринка.
Головастик.
Маленькая лягушка.
Большая лягушка.
Алгоритм развития бабочки:
Личинка.
Гусеница.
Куколка.
Бабочка.

Порядок действий, череда, определенный ритм. Все спрессовалось только в нем, в понятье — алгоритм. Куда ни кинь пытливый взгляд Он, алгоритм, везде: И в математике он есть, В природе и в тебе. Он нужен всем, он есть кругом, На нем весь мир стоит. Порядок действий — это он. Тот самый алгоритм.

Ребята, вы очень хорошо все работали. Солнышко вам всем улыбнулось и что-то вам хочет сказать: МОЛОДЦЫ.

Солнышко спрашивает: «Ребята, а с каким настроением вы закончили урок? Покажите нужную карточку: если настроение хорошее, то с изображением солнышка, если плохое — тучки» (дети показывают карточку).

Я очень рада, что ваше настроение сияет, как солнышко.

Спасибо за урок. Урок окончен.

Ответы на олимпиаду Учи.ру по русскому языку 1-4 класс (с 18 января 2022г)

18 января 2021 началась олимпиада Учи.ру по русскому языку для 1-9 классов. Олимпиада проводится в один тур. Принять участие могут все желающие. Для 1, 2, 3 и 4 класса предлагается выполнить 9 заданий: “Поговорки”, “Космический супермаркет”, “В лесу”, “Меморина”, “По двое”, “Игра в слова”, “Огни подземелья”, “Магия слов” и “Превращение животных”. Ниже представлены ответы на задания олимпиады.

1) Поговорки

Составь правильные поговорки. Для этого поменяй местами их перепутанные окончания.

1, 2 класс

Гусь свинье не товарищ.
Смелому и море по колено.
На каждый роток не накинешь платок.
Пуганая ворона и куста боится.
Маленькая собачка – до старости щенок.
Дареному коню в зубы не смотрят.
Было да сплыло.

3, 4 класс

Мягко стелет, да жёстко спать.
Смелому и море по колено.
На каждый роток не накинешь платок.
Пуганая ворона и куста боится.
Маленькая собачка – до старости щенок.
Коней на переправе не меняют.
Было да сплыло.
Дело мастера боится.

2) Космический супермаркет

Помоги Ба сделать покупки. Перетащи на корабль только те товары, в названиях которых все согласные звуки твердые.

1, 2 класс

ПЕРЕТАЩИТЬ	НЕ ПЕРЕТАСКИВАТЬ
Коржи	Голубика
Кружка	Яблоко
Огурцы	Морковь
Ватрушка	Лейка
Инжир (1кл – уксус)	Абрикос
Ложка	Кофе (1кл – тетрадь)
Карандаши	Ручка
	Орехи

3, 4 класс

ПЕРЕТАЩИТЬ	НЕ ПЕРЕТАСКИВАТЬ
Коржи	Голубика
Дрожжи	Яблоко
Огурцы	Морковь
Горошек	Щётка
Инжир	Абрикос
Пшено	Кофе
Карандаши	Ручка
	Губки

3) В лесу

Выбери признак, по которому предмету дано название.

1, 2 класс

Гриб рыжик назван так из-за… (цвета)
Кряква названа так из-за… (звуков, которые она издаёт)
Камышовка названа так из-за… (места её обитания)
Нырок назван так из-за… (способа добычи корма)
Подосиновик назван так из-за… (места, где он растёт)
Жук-олень назван так из-за… (внешнего сходства с чем-то или кем-то)

3, 4 класс

Гриб рыжик назван так из-за… (цвета)
Камышовка названа так из-за… (места её обитания)
Нырок назван так из-за… (способа добычи корма)
Рябчик назван так из-за… (своего оперения)
Шиповник назван так из-за… (особенности стебля)
Подосиновик назван так из-за… (места, где он растёт)
Овсянка названа так из-за… (любимого корма)

4) Меморина

Найди и сохрани пары однокоренных слов. Однокоренные слова имеют одинаковый корень с общим значением.

1, 2 класс

носик – носовой
половик – напольный
поляк – польский
шиповник – шипы
половинчатый – половинка
полёвка – полевой
приносил – носильщик
шипящий – шипучий
поводок – водить
вариация – вариант
вареники – варка
водяной – подводный

3, 4 класс

подгоревший – гореть
горный – горка
хоровод – заводить
нос – переносица
плоскогубцы – губа
поднос – переносить
половик – напольный
губить – загубленный
заводь – водный
полость – полый
переносица – носатый
речник – речной
речевой – просторечие
водяной – заводь
полёвка – полевой

5) По двое

Выбери окончание для названия самки животного.

1, 2, 3, 4 класс

Тигр и тигрица
Лось и лосиха
Слон и слониха
Орёл и орлица
Буйвол и буйволица
Голубь и голубка
Павлин и пава
Морж и моржиха
Гусь и гусыня
Кролик и крольчиха

6) Игра в слова

Составь из слова “олимпиада” новое слово.

1, 2 класс

Животное, похожее на большую овцу с длинной шеей, – это… (ЛАМА)
Инструмент с заострёнными зубцами – это… (ПИЛА)
Сочная съедобная часть растения – это… (ПЛОД)
Гора в Греции – это… (ОЛИМП)
Косметическое средство – это… (ПОМАДА)
Искусственный источник света – это… (ЛАМПА)

3, 4 класс

Животное, похожее на большую овцу с длинной шеей, – это… (ЛАМА)
Сочная съедобная часть растения – это… (ПЛОД)
Драгоценный камень, минерал – это… (ОПАЛ)
Сосуд для питья в Средней Азии – это… (ПИАЛА)
Косметическое средство – это… (ПОМАДА)
Искусственный источник света – это… (ЛАМПА)

7) Огни подземелья

Вставь пропущенные буквы там, где это необходимо. Чтобы вставить букву, нажми на огонёк.

1, 2 класс

Аллое соЛнце село за горризонт. Скоро наступит ночЬ, летучие мыши проснутся в своей гиганТской пещере. Они ведут ночьной образ жжизьни.

3, 4 класс

Аллое соЛнце село за горризонт. Наступает ночЬ. Летучая мышЬ скоро проснёться в своей гиганТской пещере и начнёт охотитЬся за насекоммыми. Летучие мыши ведут ночьной образ жжизьни.

8) Магия слов

Замени два слова синонимами так, чтобы они вместе составили новое слово.

1, 2, 3, 4 класс

один (РАЗ) + лес (БОР) = РАЗБОР
оболочка (КОРА) + отблеск (БЛИК) = КОРАБЛИК
наказание (КАРА) + мелководье (МЕЛЬ) = КАРАМЕЛЬ
жилище (ДОМ) + светильник (БРА) = ДОМБРА
период (ПОРА) + волокно (НИТЬ) = ПОРАНИТЬ
телега (ВОЗ) + привидение (ДУХ) = ВОЗДУХ
тон (ЦВЕТ) + баллы (ОЧКИ) = ЦВЕТОЧКИ

9) Превращение животных

Выбери такое слово, чтобы название животного стало названием предмета или понятия, то есть употреблялось в переносном смысле.

1, 2, 3, 4 класс

змей воздушный
гусеница металлическая
коньки фигурные
зайчик солнечный
мышь компьютерная
зебра дорожная
медведица большая
козёл гимнастический
жучок шпионский

Трагическая тайна мягкого яблока

Что делает одни яблоки хрустящими и сочными, а другие сухими и мучнистыми? Ответ в их клетках. Как и все живые существа, яблоки состоят из клеток. Поскольку яблоки происходят из деревьев, клетки, из которых состоит съедобная ткань яблока, имеют общие черты с другими типами растительных клеток. Чтобы понять, как яблоки приобретают свою текстуру и сочность, полезно ознакомиться с компонентами яблочной клетки.

Клеточная стенка представляет собой полужесткую кожу, покрывающую каждую клетку.Прямо внутри клеточной стенки находится тонкий гибкий слой, называемый клеточной мембраной. И клеточная стенка, и клеточная мембрана полупроницаемы, позволяя одним молекулам, но не другим, входить и выходить из клетки; эти структуры также помогают придать клетке форму. Жидкость, называемая цитоплазмой, состоящая в основном из воды, заполняет внутреннюю часть каждой клетки. Вакуоль, которая является самым большим отделом в клетке яблока, хранит большую часть воды и сахара яблока. Подобный клею материал, называемый средней пластинкой, прикрепляет соседние клетки друг к другу их клеточными стенками, в конечном итоге удерживая все клетки вместе.Будет ли яблоко хрустящим или мучнистым, сухим или сочным, зависит от состояния клеточной стенки, клеточной мембраны, цитоплазмы, вакуоли и средней пластинки.

Хрустящие и сочные яблоки

Что делает яблоко хрустящим и сочным? Когда клетки яблока молоды, они содержат обильную цитоплазму, а их вакуоли заполнены водой и сахаром. Давление вакуоли и цитоплазмы давит на клеточную стенку, как вода внутри очень полного водяного шара, делая клетку жесткой.Кроме того, срединная пластинка, склеивающая клетки между собой, особенно прочна у молодых яблок. Таким образом, ткань, состоящая из молодых клеток яблока, невероятно плотная («фактор хруста») и полна восхитительной жидкости («фактор сочности»). Когда ваши зубы врезаются в ткань молодого яблока, клетки легко разрываются, высвобождая вкусные соки, запертые внутри их вакуолей. Некоторые сорта яблок, такие как SweetTango, были выведены с очень большими клетками (с большим пространством для цитоплазмы) и очень большими вакуолями, чтобы они были особенно сочными!

Сухие и мучнистые яблоки

Почему некоторые яблоки становятся сухими и мучнистыми? Когда яблочные клетки стареют, их цитоплазма и вакуоли со временем теряют влагу и больше не могут укреплять жесткую клеточную стенку.В результате клетки становятся сдутыми и хрупкими. Средняя пластинка, которая когда-то удерживала клетки вместе, со временем также ослабевает. Когда вы надкусываете стареющее яблоко, клеточная ткань изгибается и распадается на отдельные неразрывные клетки. В результате во рту появляется кашицеобразная текстура, похожая на песок. Старые яблоки также имеют тенденцию быть более сухими, так как их вакуоли содержат меньше сока и не рвутся.

iPad + сотовая связь — Apple

Сотовые данные

Мобильные данные на iPad позволяют оставаться на связи, когда вы находитесь вдали от сети Wi-Fi.

Мобильные данные на iPad позволяют оставаться на связи, когда вы находитесь вдали от сети Wi‑Fi. ¹

Простота установки

Его невероятно легко настроить прямо с вашего iPad с помощью eSIM.

Его невероятно легко настроить прямо с вашего iPad с помощью eSIM. ²

Все в пути

Просматривайте веб-страницы, отправляйте электронные письма и сообщения, получайте доступ ко всем своим файлам и многое другое.Все на ходу.

Просматривайте веб-страницы, отправляйте электронные письма и сообщения, получайте доступ ко всем своим файлам и многое другое. Все в пути.

Оставайтесь на связи

Оставайтесь на связи с друзьями и семьей. Или сотрудничать с коллегами.

Оставайтесь на связи с друзьями и семьей. Или сотрудничайте с коллегами.

Выберите краткосрочный план

Вы можете выбрать краткосрочный план, который вам подходит. Данные за день, неделю, месяц или отпуск.

Вы можете выбрать краткосрочный план, который подходит именно вам. день неделя месяц отпуск

Просто платите по мере использования

Или получайте только тот объем данных, который вам нужен, например 1 ГБ, когда вам это нужно. Просто платите по мере использования.

180 стран и регионов

Оставайтесь на связи в более чем 180 странах и регионах.

Молниеносная скорость

Теперь на некоторых моделях и операторах вы можете получить молниеносную скорость 5G.

Теперь на некоторых моделях и операторах вы можете получить молниеносную скорость 5G. ³

Разнообразие партнеров-перевозчиков

Выберите из множества партнеров-перевозчиков или добавьте к существующему плану.

Выберите из множества партнеров-операторов или добавьте к существующему тарифному плану.

iPad + сотовая связь — Apple (RU)

Мобильные данные

Мобильные данные на iPad позволяют оставаться на связи, когда вы находитесь вдали от сети Wi‑Fi.

Мобильные данные на iPad позволяют оставаться на связи в любое время, когда вы не подключены к сети Wi‑Fi. ¹

Простота установки

Его невероятно легко настроить на вашем iPad с помощью eSIM.

Его невероятно легко настроить на вашем iPad с помощью eSIM. ²

Все в пути

Оставайтесь на связи

Оставайтесь на связи с друзьями и семьей. Или сотрудничать с коллегами.

Оставайтесь на связи с друзьями и семьей. Или сотрудничайте с коллегами.

Выберите краткосрочный план

Вы можете выбрать краткосрочный план, который вам подходит. Данные за день, неделю, месяц или праздник.

Вы можете выбрать краткосрочный план, который подходит именно вам. день неделя месяц праздник

Просто платите по мере использования

Или получайте только тот объем данных, который вам нужен, например 1 ГБ, когда вам это нужно.Просто платите по мере использования.

180 стран и регионов

Оставайтесь на связи в более чем 180 странах и регионах.

Молниеносная скорость

Теперь на некоторых моделях и операторах вы можете получить молниеносную скорость 5G.

Теперь на некоторых моделях и операторах вы можете получить молниеносную скорость 5G. ³

Разнообразие партнеров-перевозчиков

Выберите из множества партнеров-перевозчиков или добавьте к существующему плану.

Выберите из множества партнеров-операторов или добавьте к существующему тарифному плану.

iPad + сотовая связь — Apple (SA)

Сотовые данные

Мобильные данные на iPad позволяют оставаться на связи, когда вы находитесь вдали от сети Wi-Fi.

Мобильные данные на iPad позволяют оставаться на связи, когда вы находитесь вдали от сети Wi‑Fi. ¹

Простота установки

Его невероятно легко настроить прямо с вашего iPad с помощью eSIM.

Его невероятно легко настроить прямо с вашего iPad с помощью eSIM. ²

Все в пути

Оставайтесь на связи

Оставайтесь на связи с друзьями и семьей. Или сотрудничать с коллегами.

Оставайтесь на связи с друзьями и семьей. Или сотрудничайте с коллегами.

Выберите краткосрочный план

Вы можете выбрать краткосрочный план, который вам подходит.Данные за день, неделю, месяц или отпуск.

Вы можете выбрать краткосрочный план, который подходит именно вам. день неделя месяц отпуск

Просто платите по мере использования

Или получайте только тот объем данных, который вам нужен, например 1 ГБ, когда вам это нужно.Просто платите по мере использования.

180 стран и регионов

Оставайтесь на связи в более чем 180 странах и регионах.

Молниеносная скорость

Теперь на некоторых моделях и операторах вы можете получить молниеносную скорость 5G.

Теперь на некоторых моделях и операторах вы можете получить молниеносную скорость 5G. ³

Разнообразие партнеров-перевозчиков

Выберите из множества партнеров-перевозчиков или добавьте к существующему плану.

Что такое стволовые клетки яблок?

ЧТО ТАКОЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ?

Стволовые клетки уникальны тем, что они способны проходить многочисленные циклы и клеточные деления, сохраняя при этом недифференцированное состояние. Прежде всего, стволовые клетки способны к самообновлению и могут трансформироваться в другие типы клеток той же ткани. Их решающая роль заключается в восполнении умирающих клеток и регенерации поврежденных тканей.Стволовые клетки имеют ограниченный срок службы из-за внешних и внутренних факторов стресса. Поскольку их жизни угрожают внутренние и внешние стрессы, стволовые клетки необходимо защищать и поддерживать, чтобы отсрочить преждевременное старение. В стареющих организмах количество и активность стволовых клеток снижаются.

ЧТО ТАКОЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ЯБЛОКА?

Еще несколько лет назад терпкие, непривлекательные яблоки сорта Uttwiler Spätlauber, выращенные в Швейцарии, казалось, не предлагали ничего ценного.Так было до тех пор, пока швейцарские ученые не обнаружили необычайную долговечность стволовых клеток, которые поддерживали жизнь этих яблок спустя месяцы после того, как другие яблоки сморщились и упали с деревьев. В сельской местности Швейцарии, родине этих волшебных яблок, было обнаружено, что если проколоть несобранные яблоки или кору дерева, швейцарские яблони обладают способностью восстанавливаться и сохраняются дольше, чем другие сорта. В чем секрет долгой жизни этих яблок?

Эти ученые взялись за работу, чтобы выяснить это.Они обнаружили, что стволовые клетки яблок работают точно так же, как стволовые клетки человека, они поддерживают и восстанавливают ткани кожи. Основное отличие заключается в том, что, в отличие от стволовых клеток яблока, стволовые клетки кожи не имеют долгого срока службы, и как только они начинают истощаться, начинают проявляться признаки старения (в виде дряблой кожи, морщин, дряблой кожи). Пришло время использовать эти яблочные стволовые клетки для антивозрастного ухода за кожей! Не так быстро. Как уже упоминалось, яблоки Uttwiler Spätlauber в настоящее время очень редки до такой степени, что экстракт больше нельзя производить традиционным способом.Хорошая новость заключается в том, что ученые разработали технологию культивирования клеток растений, которая включает в себя выращивание стволовых клеток яблок в лаборатории.

СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ЯБЛОКА ЗАЩИЩАЮТ КЛЕТКИ КОЖИ ЧЕЛОВЕКА

Человеческие стволовые клетки в эпидермисе кожи имеют решающее значение для восполнения клеток кожи, утраченных из-за постоянного отторжения. Когда эпидермальные стволовые клетки истощаются, количество потерянных или умирающих клеток кожи превышает количество новых клеток, что угрожает здоровью и внешнему виду кожи.

Как и у людей, у растений тоже есть стволовые клетки. Введите стволовые клетки яблони Uttwiler Spätlauber, плоды которой демонстрируют исключительно долгий срок хранения. Как эти многообещающие стволовые клетки могут помочь нашей коже?

Исследования показывают, что стволовые клетки яблока повышают выработку стволовых клеток человека, защищают клетки от стресса и уменьшают морщины. Как это работает? Внутренняя жидкость этих растительных клеток содержит компоненты, которые помогают защищать и поддерживать стволовые клетки человека. Стволовые клетки яблони содержат метаболиты, обеспечивающие долговечность, поскольку дерево известно тем, что его плоды хорошо сохраняются в течение длительного периода времени.

При тестировании in vitro экстракт стволовых клеток яблока применяли к стволовым клеткам человека из пуповины, и было обнаружено, что он увеличивает количество стволовых клеток в культуре. Кроме того, добавление ингредиента к стволовым клеткам пуповины, по-видимому, защищает клетки от воздействия окружающей среды, такого как ультрафиолетовое излучение.

Стволовые клетки яблока не нужно вводить через пуповину, чтобы принести пользу нашей коже! Экстракт, полученный в результате технологии культивирования растительных клеток, используется в качестве активного ингредиента в продуктах по уходу за кожей против старения.При введении в кожу нанотехнологий стволовые клетки яблока обеспечивают более впечатляющие результаты в уменьшении линий, морщин и вредного воздействия окружающей среды.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Интенсивные исследования, которые в настоящее время называют «Источником молодости», доказали, что даже при уровне концентрации 0,1 % PhytoCellTec (экстракт стволовых клеток яблока) может пролиферировать множество человеческих стволовых клеток путем поразительные 80%! Эти чудо-клетки работают очень эффективно и абсолютно безопасны.Из многочисленных полезных свойств стволовых клеток яблок наиболее важными являются:

Повышение жизнеспособности и долголетия стволовых клеток кожи
Восстанавливает поврежденные ткани и органы
Активирует регенерацию собственных стволовых клеток кожи
Защищает стволовые клетки человека от гибели, вызванной УФ-излучением
Борется с хронологическим и генетическим старением и глубокими морщинами
Местное применение уменьшает глубину морщин «гусиных лапок» уже через две недели
Борется с преждевременным старением и тонкими линиями
Восстанавливает экологический ущерб
60-дневный результат гарантирован

Перспективный способ выращивания частей тела… с помощью яблока |

Алексис Уильямс.

Биохакер и стипендиат TED Эндрю Пеллинг создает живые, функциональные биологические объекты, которых не существует в природе, без какой-либо преднамеренной модификации ДНК. В своей лаборатории в Оттавском университете он даже придумал, как использовать яблоки и человеческие клетки для изготовления ушей в чашке Петри. Но как вы это делаете и, что более важно, зачем вам это нужно? Ответ на удивление прост и может означать более широкий доступ к медицинским инновациям и благополучию для всех.

Итак.Об этих ушах. Это настоящие человеческие уши? Они… слышат? Ответ сложный. Да, уши состоят из настоящих живых человеческих клеток, но материал, который придает им структуру — каркас — это яблочная целлюлоза. Уши были вырезаны в целлюлозе вручную (как оказалось, женой Пеллинга). Подумайте о топиарии. И нет, они не слышат.

Это может показаться просто жутким научно-художественным проектом, но он демонстрирует важный момент: человеческие клетки могут процветать на волокнистых структурах растений.И почему это важно? Потому что это предполагает возможность недорогого, доступного во всем мире биоматериала, с помощью которого мы могли бы реконструировать наши разваливающиеся тела: кожу, кости, вены, органы и так далее.

Эндрю Пеллинг. Не ешьте это яблоко. Фото: Себастьян Хаджиантониу.

Вот как сейчас ученые пытаются изготовить сменные части тела. Выращенные в лаборатории органы находятся на переднем крае медицины, и ученые экспериментируют с выращиванием костей, хрящей и даже более сложных органов, таких как почки и сердце.Но всем им нужен базовый материал, который может содержать живые клетки. «Общепринято мнение, что строительные леса должны быть как можно более естественными для человеческого тела», — говорит Пеллинг. Существует несколько подходов к созданию таких каркасов, но в одном многообещающем подходе используется существующий каркас донорского органа. В этом случае ученые удаляли донорские клетки из ткани, использовали то, что осталось, в качестве белкового каркаса, заселяли его стволовыми клетками пациента, а затем пересаживали орган обратно пациенту.(В сердце то, что остается после извлечения донорских клеток, выглядит как белое «призрачное сердце» и в основном состоит из коллагена.) Это может быть чертовски сложный процесс, и до сих пор ученые видели успех только в более простых органов, таких как мочевой пузырь. «До сих пор неизвестно, будет ли он работать с таким органом, как сердце», — говорит Пеллинг.

Ученые также десятилетиями пытались разработать синтетические каркасы, в которых могли бы расти кровеносные сосуды.Это тоже может быть сложным и дорогим. «Эквивалентное количество синтетического коммерческого биоматериала, необходимого для создания органа, иногда может стоить на рынке тысячи долларов», — говорит Пеллинг.

Уши вырезаны из яблочной целлюлозы, пропитанной живыми человеческими клетками. Фото: Эндрю Пеллинг.

Яблоки? Яблоки растут на деревьях. Яблоки дешевые. В то время как в предыдущих попытках использовалась синтетическая или сильно переработанная натуральная целлюлоза, в лаборатории Пеллинга возникла идея использовать растительную целлюлозу прямо из яблока, с очень небольшим количеством этапов обработки и как можно проще.«Наша гипотеза заключалась в том, что яблочная целлюлоза будет действовать точно так же, как любые другие строительные леса», — говорит Пеллинг, который руководит финансируемой государством Лабораторией биофизических манипуляций Пеллинга в Университете Оттавы и давно интересуется экспериментальной биофизикой, как эта область известна. . «Чтобы добраться до целлюлозы, аспирант Даниэль Модулевски разработал протокол, согласно которому вы нарезаете яблоко, моете его водой с мылом, а затем стерилизуете. Остается тонкая сетка из целлюлозы, в которую можно вводить человеческие клетки — и они растут.— говорит Пеллинг. Следующий закономерный вопрос: можно ли его имплантировать? Ответ, как обнаружил Пеллинг, положительный. «Затем Модулевский сотрудничал со старшим научным сотрудником лаборатории Шарлем Куэрье и обнаружил, что, когда вы имплантируете его под кожу, окружающие клетки входят в сетку и посылают сигналы для создания кровоснабжения, и она становится живой частью тела».

Способ выходит за пределы ушей на яблоках. Однажды спаржа может помочь восстановить колючки. В настоящее время исследователи изучают другие овощи, чтобы изучить их возможные полезные свойства.«Иногда лаборатория выглядит как фермерский рынок, когда мы запасаемся припасами, потому что мы исследовали каждое растение, до которого смогли добраться», — говорит Пеллинг. В природе уже существует много интересных структур, которые можно использовать в качестве каркасов для ремонта различных частей человеческого тела. «Некоторые растения имеют трехмерные структуры, очень похожие на существующие коммерческие синтетические каркасы», — говорит он. Но если есть коммерческие продукты, зачем возиться с растениями? Ну, спрашивает он: «Если это легко производить и природа уже сделала за нас всю работу, то почему бы и нет?» Лаборатория Пеллинга в настоящее время изучает другие растения-кандидаты, такие как груши, спаржа и грибы, на предмет их потенциала в восстановлении костей, нервов и кожи.

Новый подход к инновациям: «помешанные эксперименты». Лаборатория Пеллинга не собиралась создавать новый способ изготовления материалов для тканевой инженерии. «На самом деле мы шутили о создании растения-монстра Одри II в «Магазинчик ужасов », — говорит Пеллинг. Что подводит нас к ценности игры. Пеллинг описывает свою лабораторию как игровое, исследовательское пространство, где ученые, инженеры и художники собираются, чтобы задавать вопросы и пытаться придумать, как на них ответить, не привязываясь к результату.«Это просто среда, в которой людям может быть любопытно», — говорит он. «Мы не начинаем намеренно проводить исследования с реальными приложениями».

На самом деле, рыться в мусорных баках в поисках оборудования для разборки и сборки (просто для развлечения) заставило Пеллинга задуматься, сможет ли он проделать аналогичный процесс с живой системой. Вернувшись в лабораторию, эта идея превратилась в эксперимент с яблоком. «К нашему удивлению, это оказалось намного проще, чем мы думали, и после некоторой оптимизации это в конечном итоге сработало», — говорит он, добавляя, что этого могло бы вообще не случиться, если бы он думал традиционно.«Честно говоря, мы использовали подход каменного века».

Лаборатория Пеллинга, где правят «безумные эксперименты», а материалы часто берутся из мусорных баков. Даниэль Модулевски (справа) разработал протокол для каркасов из биоматериала из целлюлозы, полученной из яблок. Фото: Питер Торнтон, Оттавский университет.

Это не генетически модифицированный продукт и не синтетическая биология. Так как это называется? «Когда вы говорите: «О, я сделал яблоко с человеческими клетками», люди сразу же думают о генетической модификации, — говорит Пеллинг.«Но мы не трогаем геном. На самом деле, это интересно тем, что мы трансформировали биологическую функцию, не манипулируя кодом ДНК». Итак, как мы должны думать об этом поле? «Я называл это «дополненной биологией», — говорит он. «На самом деле, это развитие старой идеи. Мы уже увеличиваем свое тело: татуировками, пирсингом, пломбами». Тем не менее, идея Пеллинга достаточно необычна, чтобы иногда было сложно найти финансирование. Пока что начальные гранты позволили ему провести доклинические исследования, проверяя безопасность и совместимость имплантатов на мышах.

«Как только люди перестают осознавать, что это имплантат, полученный из яблока, они понимают, что мы не делаем ничего существенно отличающегося от современных технологий», — говорит Пеллинг. «Мы просто делаем это дешево и легко, и мы устранили несколько барьеров, так что это действительно может иметь реальное влияние. Теперь, когда мы зашли так далеко, мне очень любопытно узнать, что на самом деле возможно, а что нет».

Возможно, вы тоже начнете лепить органы на своей кухне. Пеллинг убежден, что научные исследования и инновации должны быть открыты для всех.«Меня действительно беспокоит, что научное оборудование может быть очень дорогим, что иногда создает неравный доступ к материалам и оборудованию исследовательского уровня», — говорит он. «Я всегда думаю о том, как мы можем просто и дешево заниматься сложной наукой — когда это возможно».

С этой целью Пеллинг, Модулевски и Кюррье соучредили компанию Spiderwort для продажи комплектов оборудования, необходимого для производства биоматериалов на основе целлюлозы, и инкубаторов, необходимых для выращивания клеток человека и животных. «Инкубаторы — это, по сути, теплые ящики, 37 градусов по Цельсию, которые контролируют содержание углекислого газа в атмосфере, – говорит он.Пеллинг сам спроектировал инкубатор и построил первые из компонентов, которые он нашел в мусоре. Он опубликовал инструкции в открытом доступе, но впоследствии получил запросы от биоискусства и научных сообществ на наборы. «Никто не хотел искать материалы на помойке, — говорит он, — поэтому мы создали набор, и сейчас он проходит бета-тестирование». Компания работает над более крупной платформой с открытым исходным кодом для биологического оборудования и программного обеспечения, стремясь предоставить возможность всем, от самодельных гражданских научных лабораторий, академических лабораторий и даже больниц, создавать эти биоматериалы.

Мечтой Пеллинга для его работы являются индивидуально настроенные органы. Фото: Город Оттава, Биоарт: сотрудничество с жизнью.

«Кудрявую, пожалуйста». Помимо прагматичных целей, Пеллинг рассматривает как художественные, так и медицинские усовершенствования. «Отлитые в форму и напечатанные на 3D-принтере органы — это хорошо, — говорит он, — но если их производить массово, есть вероятность, что каждый орган в партии будет выглядеть действительно одинаково. Мне нравится идея о том, что наши органы выражают некоторую индивидуальность.Может быть, вы вырезали бы себе ухо или поручили бы его создать художнику, а не использовали бы обычный имплантат от компании. Интересно подумать о том, как люди могут взять на себя ответственность за то, как выглядят их органы и имплантаты, и, возможно, даже как функционируют их тела».

Каркасы из целлюлозы, полученной из яблок, для 3D-культуры клеток млекопитающих

Abstract

Существует множество подходов к созданию природных и синтетических трехмерных каркасов, поддерживающих пролиферацию клеток млекопитающих.Трехмерные каркасы лучше представляют естественную клеточную микросреду и имеют множество потенциальных применений in vitro и in vivo . Здесь мы демонстрируем, что 3D целлюлозные каркасы, полученные путем децеллюляризации ткани гипантия яблока, могут быть использованы для in vitro 3D культуры фибробластов NIh4T3, мышечных миобластов C2C12 мыши и эпителиальных клеток HeLa человека. Мы показываем, что эти клетки могут прикрепляться, внедряться и размножаться в целлюлозных каркасах. Кроме того, для контроля биохимии поверхности и/или механических свойств каркаса можно использовать биохимическую функционализацию или химическое сшивание.Клетки сохраняют высокую жизнеспособность даже после 12 недель непрерывного культивирования и могут достигать плотности клеток, сравнимой с другими природными и синтетическими материалами каркаса. Каркасы из яблочной целлюлозы легко производить, они недороги и производятся из возобновляемых источников. Взятые вместе, эти результаты демонстрируют, что природные целлюлозные каркасы предлагают дополнительный подход к существующим методам культуры клеток млекопитающих in vitro в трехмерной среде.

Образец цитирования: Модулевский Д.Дж., Лефевр С., Хаазе К., Аль-Рекаби З., Пеллинг А.Е. (2014) Целлюлозные каркасы из яблок для трехмерной культуры клеток млекопитающих.ПЛОС ОДИН 9(5): е97835. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0097835

Редактор: Ирина Керкис, Instituto Butantan, Бразилия

Поступила в редакцию: 13 ноября 2013 г.; Принято: 24 апреля 2014 г .; Опубликовано: 19 мая 2014 г.

Copyright: © 2014 Modulevsky et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания оригинального автора и источника.

Финансирование: Эта работа стала возможной благодаря поддержке Оттавского университета и гранта Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям (NSERC). К.Л. был поддержан премией NSERC для студентов бакалавриата в области исследований, Z.A.R. была поддержана стипендией выпускника программы обучения NSERC-CREATE по количественному анализу. А.Э.П. выражает благодарность Канадской программе научных кафедр и награду провинции Онтарио для первых исследователей. Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Эндрю Пеллинг является членом редакционной коллегии PLOS ONE, и это не меняет приверженности авторов всем политикам PLOS ONE в отношении обмена данными и материалами.

Введение

Разработка новых биоматериалов для культуры клеток in vitro в трехмерной (3D) микросреде в последние годы набирает обороты [1]–[6]. Мотивация этой разработки состоит в том, чтобы компенсировать ограничения современных методов двумерного (2D) культивирования клеток.В частности, двумерные пластиковые или стеклянные подложки повсеместно используются для изучения многих биологических процессов, несмотря на очевидные структурные и механические различия с микросредой in vivo . In vivo клетки находятся в сложном внеклеточном матриксе (ECM), биохимические и физические свойства которого оказывают значительное влияние на многочисленные критические физиологические и патологические процессы [7]. Значительные морфологические и биологические различия уже наблюдались между клетками, выращенными в 2D и 3D микросредах [8], [9].Обычно наблюдается, что первичные клетки, выделенные из тканей, становятся все более плоскими при культивировании на обычных 2D-поверхностях [10], [11]. И наоборот, клетки, культивируемые на 2D-поверхностях, могут восстановить свою 3D-морфологию при помещении в 3D-каркас для культивирования [12]. Трехмерная культура клеток обещает более точно отразить биохимические и физические свойства клеточной микросреды, обнаруженной в тканях и органах [13], и поэтому разработка новых биоматериалов для этих усилий имеет большое значение.

Как синтетические, так и натуральные материалы в настоящее время используются в методах 3D-культивирования для создания настраиваемых каркасов с определенными биохимическими и физическими свойствами. Целлюлоза, основной компонент клеточных стенок растений, представляет собой органический полисахарид, состоящий из субъединиц D-глюкозы через связи β(1–4). В отличие от полисахаридов крахмала и гликогена, целлюлоза обеспечивает очень мало питательной энергии, поскольку гликозидные связи β(1–4) трудно перевариваются и могут быть расщеплены только целлюлазой [14].Таким образом, большое внимание уделяется использованию целлюлозы в качестве биоматериала-кандидата [12], [15]–[23]. Целлюлоза ранее использовалась в качестве проницаемой диализной мембраны и в качестве мембраны, ограничивающей диффузию, в биосенсорах [24]. Кроме того, предыдущие исследования показали, что целлюлоза, вырабатываемая бактериями, может поддерживать пролиферацию клеток млекопитающих [20], [25], [26]. Синтетически полученные целлюлозные каркасы также использовались для трехмерной культуры клеток млекопитающих [2], [19], [21], [23]. Миоциты, культивированные на этих синтетических целлюлозных каркасах, содержали периодические миофибриллы, отдельный элемент цитоархитектоники внутри зрелых кардиальных миоцитов [27].Кроме того, улучшенная связь в виде повышенной плотности щелевых контактов и электрохимическая связь в результате 3D-культуры по сравнению с клетками, выращенными на стекле [27]. Эти примеры предполагают, что целлюлоза может быть подходящим материалом для поддержки трехмерного роста клеток. Более того, целлюлоза широко доступна, так как это наиболее распространенный органический полимер, на долю которого приходится 1,5×10 ¹² тонн общего годового производства биомассы [28].

Ткань гипантия яблони имеет внутреннюю структуру, состоящую из клеточных стенок, которые охватывают поры и воздушные карманы, облегчая транспортировку питательных веществ и воды через мясистую ткань.Эти естественно развитые характеристики важны для любого каркаса, используемого для 3D-культуры клеток [29]. Чтобы действовать как трехмерный каркас, ткань гипантия яблони должна быть сначала децеллюляризована, чтобы удалить существующие нуклеиновые кислоты, липиды и белки, создавая каркас из очищенной целлюлозы. Децеллюляризация в настоящее время широко используется в тканях млекопитающих для избирательного удаления клеточных компонентов, при этом остается неповрежденный ВКМ [30]–[33]. форма исходной ткани [34]–[43].Затем децеллюляризованная ткань может быть заселена новыми клетками для создания новых функциональных органов. Сердце, почки были децеллюляризированы и пересажены различными клетками [33], [41]–[43]. Кроме того, с помощью этой техники были получены и трансплантированы животным функциональные мочевые пузыри и легкие [44], [45]. Важно отметить, что децеллюляризованная ткань также поддерживает хорошо консервативную нативную архитектуру ECM и домены связывания клеток-ECM [41].

В этом исследовании мы предположили, что децеллюляризованная ткань гипантия яблони может обеспечить легко производимый каркас для 3D-культуры клеток.Основная цель этого исследования состояла в том, чтобы продемонстрировать, что клетки млекопитающих могут успешно пролиферировать в трехмерном целлюлозном каркасе in vitro. Модифицировав существующий протокол децеллюляризации, мы создали целлюлозные каркасы из яблок для культивирования клеток. Мы исследовали, как три типа клеток млекопитающих (мышиные фибробласты NIh4T3, мышиные миобласты C2C12 и эпителиальные клетки HeLa человека) пролиферируют в этих каркасах в течение двенадцати недель. Фазово-контрастную микроскопию, лазерную сканирующую конфокальную микроскопию и сканирующую электронную микроскопию использовали для характеристики структуры каркасов, роста клеток, морфологии клеток и влияния каркасов на актиновый цитоскелет.Мы также модифицировали биохимию поверхности и механические свойства целлюлозных каркасов путем функционализации коллагена или химического сшивания глутаровым альдегидом. Для количественной оценки влияния этих модификаций на механические свойства каркасов использовали атомно-силовую микроскопию. Мы демонстрируем, что 3 линии клеток млекопитающих, использованные в этом исследовании, были способны размножаться и оставаться жизнеспособными в трехмерном целлюлозном каркасе in vitro, достигая плотности клеток, аналогичной другим синтетическим и природным биоматериалам.Учитывая природную пористость и простоту производства целлюлозных каркасов, а также возможность изменять их механические свойства, мы демонстрируем, что целлюлозные каркасы являются потенциально полезным биоматериалом, который можно успешно использовать для трехмерной культуры клеток in vitro.

Материалы и методы

Подготовка ткани яблока, децеллюляризация и хранение

яблока McIntosh Red (Canada Fancy) хранили при 4°C в темноте не более двух недель. Чтобы приготовить яблочные срезы, фрукты сначала охлаждали в морозильной камере при температуре -20°C в течение 5 минут, а затем нарезали слайсером-мандолиной до однородной толщины 1.20±0,14 мм, измерено штангенциркулем (рис. 1 А-Б). Использовали только внешнюю (гипантий) ткань яблока. Срезы, содержащие видимую ткань ядра яичника, не использовали. Затем ломтики разрезали на сегменты размером 2,0×0,5 см параллельно направлению цветоножки яблока (рис. 1С). Затем ткань яблока децеллюляризировали с использованием хорошо зарекомендовавшего себя протокола [41] для удаления клеточного материала и ДНК из образцов ткани, оставляя неповрежденный трехмерный каркас. Отдельные образцы ткани яблока помещали в стерилизованную камеру 2.В каждую пробирку добавляли 5 мл микроцентрифужных пробирок и 2 мл 0,5% раствора додецилсульфата натрия (SDS) (Sigma-Aldrich). Образцы встряхивали в течение 12 часов при 160 об/мин при комнатной температуре (рис. 1D). Затем полученные целлюлозные каркасы переносили в новые стерильные микроцентрифужные пробирки, промывали и инкубировали в течение 6 часов в PBS (Sigma-Aldrich) с 1% стрептомицина/пенициллина (HyClone) и 1% амфотерицина В (Wisent). В этот момент образцы немедленно использовали или хранили в PBS при 4°C не более 2 недель.

Рис. 1. Мультипликационная схема, представляющая протокол децеллюляризации ткани яблока и посева клеток млекопитающих, использованный в этом исследовании.

A) Яблоки McIntosh Red подвергались воздействию температуры -20°C в течение не более 5 минут, чтобы повысить прочность внешней ткани гипантия яблока. Б) Однородные ломтики яблок толщиной 1,2 ± 0,1 мм были получены с помощью слайсера-мандолины. Ломтики, содержащие сердцевину завязи яблока, удаляли. C) Ломтики яблока были нарезаны в форме 2.0 на 0,5 см, которые помещали в отдельные микроцентрифужные пробирки. D) В микроцентрифужные пробирки добавляли 0,5% раствор SDS и помещали на шейкер на 12 часов при комнатной температуре. Затем каркасы неоднократно промывали PBS и оставляли инкубироваться в растворе PBS с 1% стрептомицина/пенициллина и 1% амфотерицина В в течение 6 часов при комнатной температуре. E) Затем каркасы покрывали коллагеном типа 1, химически сшивали глутаровым альдегидом или инкубировали в PBS. F) Затем все образцы инкубировали в среде для культивирования клеток млекопитающих (DMEM) в течение 12 часов в стандартном инкубаторе для культивирования тканей при температуре 37°C и 5% CO ₂ .G) Каркасы помещали в 24-луночные планшеты, покрытые PDMS, и на каждый помещали клеточную суспензию объемом 40 мкл. Через 6 часов в инкубаторе лунки заполняли DMEM и клетки культивировали до 12 недель.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0097835.g001

Лечение после децеллюляризации

Здесь мы исследовали клеточную пролиферацию и инвазию в нативные, функционализированные коллагеном или химически сшитые целлюлозные каркасы. Для функционализации каркасов коллагеном образцы инкубировали в течение 6 часов в растворе 10% уксусной кислоты и 1 мкг/мл коллагена крысиного хвоста типа I (Invitrogen) с последующим промыванием в PBS перед использованием.Для химического сшивания каркасов образцы инкубировали в 1% растворе глутарового альдегида марки EM (Sigma-Aldrich) в течение 6 часов. Затем каркасы промывали в PBS и инкубировали в течение ночи в растворе 1% боргидрида натрия (Sigma-Aldrich), чтобы уменьшить количество непрореагировавшего глутарового альдегида (рис. 1E). Перед посевом клеток на матриксы все образцы (нативные, покрытые коллагеном или сшитые) инкубировали в среде для культивирования клеток млекопитающих (описано ниже) в течение 12 часов в стандартном инкубаторе для культивирования тканей при 37°C с 5% CO. ₂ (рис.1F).

Культура клеток

В этом исследовании использовали

мышиных миобластов C2C12, мышиных фибробластов NIh4T3 и эпителиальных клеточных линий человека HeLa (все они получены из Американской коллекции типовых культур (ATCC)). Клетки культивировали в стандартных средах для культивирования клеток (DMEM с высоким содержанием глюкозы (HyClone), с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone), 1% пенициллина/стрептомицина (HyClone) и 1% амфотерицина В (Wisent) при 37°C и 5% CO ₂ в колбах T75 (Thermo Scientific).Культуральную среду заменяли каждый второй день, и клетки пассировали при 80% слиянии.

Культура клеток in vitro в целлюлозных каркасах

Процедура посева каркаса проводилась в 24-луночных планшетах для тканевых культур. Каждую лунку по отдельности покрывали полидиметилсилоксаном (ПДМС) для создания гидрофобной поверхности и предотвращения адгезии клеток. В каждую лунку заливали раствор отвердителя: эластомер (Sylgard 184, Ellsworth Adhesives) в соотношении 1:10. PDMS отверждали в течение 2 часов при 80°C, давали остыть до комнатной температуры, затем промывали PBS.Каркасы разрезали на кусочки размером 0,5×0,5 см и помещали в каждую лунку. Каплю объемом 40 мкл, содержащую 6×10 ⁶ клеток, аккуратно формировали поверх каждого каркаса. Образцы помещали в инкубатор на 6 часов, чтобы клетки могли прикрепиться к каркасам. Затем в каждую лунку добавляли 2 мл DMEM и образцы инкубировали в течение 48 часов. Затем образцы, содержащие клетки млекопитающих, осторожно переносили в новые 24-луночные планшеты для тканевых культур, покрытые PDMS. Для продолжения пролиферации клеток культуральную среду заменяли каждый день, а каркасы переносили в новые 24-луночные планшеты каждые 2 недели.

Иммунофлуоресцентное окрашивание

Актиновый цитоскелет и ядра клеток млекопитающих, культивируемых на стекле или в матриксах, окрашивали в соответствии с предыдущими протоколами [46], [47]. Вкратце, образцы фиксировали 3,5% параформальдегидом и пермеабилизировали Triton X-100 при 37°C. Актин окрашивали фаллоидином, конъюгированным с Alexa Fluor 488 (Invitrogen), и окрашивали ядра, метя ДНК DAPI (Invitrogen). Затем образцы монтировали в Vectashield (Vector Labs).

Для одновременного окрашивания целлюлозного каркаса и клеток млекопитающих мы сначала фиксировали образцы, как описано выше, а затем 3 раза промывали их PBS. Чтобы пометить стенки клеток яблока, мы использовали установленный протокол, описанный ранее Trueunit et al. (2008) [48]. Образцы промывали водой и инкубировали в 1% йодной кислоте (Sigma-Aldrich) при комнатной температуре в течение 40 минут. Ткань снова промывали водой и инкубировали в реактиве Шиффа (100 мМ метабисульфита натрия и 0.15 N HCl) с 100 мг/мл йодида пропидия (Invitrogen) в течение 2 часов. Затем образцы промывали PBS. Для визуализации клеток млекопитающих в ткани яблока образцы инкубировали с раствором 5 мкг/мл агглютинина зародышей пшеницы (АЗП) 488 (Invitrogen) и 1 мкг/мл Hoechst 33342 (Invitrogen) в HBSS (20 мМ HEPES при рН 7,4; 120 мМ NaCl; 5,3 мМ KCl; 0,8 мМ MgSO ₄; 1,8 мМ CaCl ₂ и 11,1 мМ декстрозы). WGA и Hoechst 33342 представляют собой живые клеточные красители, которые маркируют клеточную мембрану и ядро млекопитающих соответственно.Затем образцы переносили на предметные стекла микроскопа и заключали в раствор хлоралгидрата (4 г хлоралгидрата, 1 мл глицерина и 2 мл воды). Слайды выдерживали в течение ночи при комнатной температуре в закрытой среде для предотвращения обезвоживания. Затем образцы помещали в PBS до тех пор, пока они не были готовы для визуализации.

Мы также пометили образцы для проверки долгосрочной жизнеспособности клеток млекопитающих. В этих случаях клетки поддерживали в культуре в течение 12 недель, а затем окрашивали раствором 1 мкг/мл Hoechst 33342, который окрашивает ядра всех клеток, и 1 мкг/мл йодида пропидия (PI), который непроницаем для клеточных мембран и окрашивает только нуклеиновые кислоты апоптотических или некротических клеток.Затем образцы фиксировали 3,5% параформальдегидом, как указано выше, а затем погружали в PBS до тех пор, пока они не были готовы к конфокальной визуализации. Для количественной оценки количества жизнеспособных клеток готовили и окрашивали n = 3 образца. Отдельные Hoechst-положительные и PI-положительные клетки автоматически подсчитывались с использованием функции анализатора частиц в ImageJ.

Оптическая микроскопия

Конфокальная визуализация выполнялась с помощью высокоскоростной лазерной сканирующей конфокальной системы A1R на платформе инвертированного оптического микроскопа TiE (Nikon, Канада) с соответствующими лазерными линиями и наборами фильтров.Изображения в проходящем свете были получены на инвертированном микроскопе TiE (Nikon, Канада) с фазово-контрастной оптикой. Изображения анализировали с использованием программного обеспечения открытого доступа ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Единственными манипуляциями с изображениями были настройки яркости и контрастности.

Сканирующая электронная микроскопия

Каркасы, содержащие клетки млекопитающих, сначала фиксировали 3,5% параформальдегидом, как описано выше, а затем осторожно многократно промывали PBS. Затем образцы обезвоживали последовательными градиентами этанола (50%, 70%, 95% и 100%) и сушили в лиофилизаторе.Затем образцы покрывали золотом при токе 15 мА в течение 3 минут с помощью устройства ионного распыления Hitachi E-1010. СЭМ-изображение проводилось при напряжении в диапазоне от 2,00 до 10,0 кВ на JEOL JSM-7500F FESEM.

Атомно-силовая микроскопия (АСМ)

АСМ

использовали для измерения механических свойств нативных, функционализированных коллагеном или химически сшитых (n = 3 в каждом случае) целлюлозных каркасов. Во всех случаях кантилеверы АСМ PNP-TR-TL (Nano world) без наконечника были модифицированы шариками полистирола размером 10 мкм (Fluka) с использованием оптического клея (Norland), отвержденного в УФ-сшивателе (Spectroline Select Series).Консоли имели среднюю жесткость пружины 37±5 пН/нм, определенную методом термофлуктуаций [49], [50]. Локальные механические свойства измеряли по 5–15 кривым силы-вдавливания, собранным в 10–15 случайно выбранных местах с частотой 1 Гц. Всего было получено n = 200 измерений для каждого образца. Программное обеспечение PUNIAS использовалось для согласования первых 200 нм отпечатка с моделью Герца для сферического индентора с использованием коэффициента Пуассона 0,5 [46], [50], [51].

Статистический анализ

Все представленные значения являются средним значением ± стандартное отклонение.Там, где это применимо, мы оценивали статистическую значимость, выполняя t-критерий Стьюдента для двух выборок (α<0,05).

Результаты

Изготовление каркасов из целлюлозы

Как описано в разделе «Материалы и методы», ткань гипантия яблони разрезали до одинакового размера и децеллюляризировали в соответствии с установленными протоколами (рис. 1) [41]. Была использована ткань гипантия, так как она богата целлюлозой и содержит очень мало клеток [52, 53]. Протоколы децеллюляризации использовались для обеспечения полного удаления любых оставшихся растительных клеток, нуклеиновых кислот и биомакромолекул.После обработки образцов при фазово-контрастной микроскопии наблюдается высокопористая структура (рис. 2А). Ткань яблока превратилась в очень пористую структуру с полостями в клеточных стенках, наблюдаемыми по всему образцу, что позволяет облегчить перенос питательных веществ. Затем целлюлозные каркасы фиксировали и обезвоживали для визуализации с помощью СЭМ. Образцы разрезали горизонтально по средней части, обнажая внутреннюю поверхность. Отчетливо виден высокопористый и относительно прочный каркас (рис.2Б). Во всех случаях целлюлозный каркас был единственной очевидной особенностью, наблюдаемой на всех изображениях, поскольку никаких других идентифицируемых структур (например, клеточных органелл или чего-либо другого) обнаружено не было.

Рис. 2. Каркасы из децеллюляризованной целлюлозы.

A) Фазово-контрастное изображение структуры клеточной стенки целлюлозы в образце децеллюляризованной ткани яблока. Темные линии соответствуют отчетливым структурам целлюлозы, образующим трехмерную матрицу. B) СЭМ-изображение аналогичного целлюлозного каркаса, показывающее его трехмерную природу и большие полости.Масштабная линейка = 200 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0097835.g002

Механические свойства каркасов из нативной и модифицированной целлюлозы

Мы использовали два протокола функционализации после децеллюляризации, чтобы изучить легкость модификации механических свойств этих целлюлозных каркасов. Две модификации включали функционализацию каркаса коллагеном типа I или химическое сшивание каркаса глутаровым альдегидом.Эти модификации позволили нам контролировать биохимическую среду каркасов и изменять их механические свойства. АСМ использовали для количественной оценки локальной эластичности каркасов в ответ на каждую обработку. Мы измерили эластичность четырех конкретных образцов: необработанной (нативной), децеллюляризованной (SDS), децеллюляризованной и функционализированной коллагеном (SDS+Coll) и, наконец, децеллюляризованной и сшитой глутаральдегидом (SDS+GA) ткани. Нативная ткань, каркасы SDS, SDS+Coll и SDS+GA обладали эластичностью, равной 0.9±0,1 кПа, 1,1±0,1 кПа, 2,2±0,2 кПа и 4,1±0,3 кПа соответственно (рис. 3А). Нативные каркасы и каркасы с ДСН не показали каких-либо существенных различий в механических свойствах ( p >0,05). Как каркасы SDS+Coll, так и SDS+GA показали значительное увеличение эластичности по сравнению с нативными и децеллюляризованными каркасами (90–210 p 90–211 <0,001). Эти результаты демонстрируют, что локальную эластичность каркасов можно четко контролировать, чтобы они попадали в диапазон, имитирующий некоторые ткани млекопитающих [54, 55]. Наконец, клетки C2C12 высевали в различные препараты каркасов (SDS, SDS+Coll и SDS+ GA, n = 3 в каждом случае) и культивировали в течение 2 недель (рис. 3B-D).Фазово-контрастная микроскопия выявила присутствие клеток млекопитающих в каждом из каркасов по сравнению с целлюлозным каркасом, представленным на рис. 2А. Показанные изображения являются репрезентативными для n = 3 каркасов, приготовленных в каждом случае.

Рис. 3. Механические свойства трехмерных каркасов из функционализированной целлюлозы и миобластов C2C12, культивируемых в трехмерных каркасах из целлюлозы.

A) Локальная механическая эластичность нативной ткани, децеллюляризованной (SDS), функционализированной коллагеном (SDS+Coll) и глутаральдегидной (SDS+GA) сшитой целлюлозы каркасов.Нативная ткань и немодифицированные матриксы не имеют существенной разницы в механических свойствах. Как функционализированные коллагеном, так и химически сшитые каркасы продемонстрировали значительное увеличение эластичности по сравнению с каркасами DMEM (*** = p <0,001). (B) децеллюляризованный (SDS), (C) функционализированный коллагеном (SDS+Coll) и (D) сшитый глутаральдегидом (SDS+GA) каркасы поддерживают рост клеток C2C12. Фазово-контрастные изображения клеток C2C12 после двух недель роста показывают наличие клеточных колоний.Масштабная линейка = 200 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0097835.g003

Культура клеток млекопитающих в каркасах из нативной, функционализированной коллагеном и химически сшитой целлюлозы

Чтобы проверить способность целлюлозных каркасов поддерживать трехмерную культуру клеток млекопитающих, мы исследовали пролиферацию миобластов мыши C2C12, фибробластов мыши NIh4T3 и эпителиальных клеток HeLa человека в нативных, функционализированных коллагеном или химически сшитых целлюлозных каркасах (n = по 3 в каждом случае).Во всех случаях пролиферация клеток была одинаковой. После 4 недель культивирования для каждого образца были созданы иммунофлуоресцентные изображения, чтобы выборочно визуализировать клетки млекопитающих внутри клеточной стенки яблока. Отчетливая структура клеточных стенок наблюдалась во всех условиях и представляла собой однородную тонкую красную структуру, образующую отдельные полости одинакового размера (см. рис. 4). Интересно, что аналогичные наблюдения были сделаны для структуры целлюлозы на изображениях СЭМ (рис. 2б). Клеточные мембраны (зеленые) и ядра (синие) миобластов C2C12 (рис.4A), фибробласты мыши NIh4T3 (фиг. 4B) и эпителиальные клетки HeLa человека (фиг. 4C) явно очень хорошо пролиферируют как в немодифицированных (фиг. 4A-C), так и в модифицированных каркасах (данные не показаны). Наблюдали рост клеток на поверхности каркасов.

Рис. 4. Фиксированные и окрашенные клетки NIh4T3, C2C12 и HeLa, культивированные на трехмерных целлюлозных каркасах.

Специфическое флуоресцентное окрашивание (A) клеток млекопитающих NIh4T3, (B) C2C12 и (C) HeLa внутри целлюлозных каркасов и последующая лазерная сканирующая конфокальная микроскопия выявляют структуру целлюлозы (красный), мембраны клеток млекопитающих (зеленый) и ядра (синий ).Клетки культивировали в этих каркасах в течение четырех недель перед окрашиванием и визуализацией. Конфокальные объемы были получены и спроецированы в плоскостях XY и ZY. Ортогональные проекции ZY демонстрируют глубину пролиферации клеток внутри целлюлозного каркаса. Указаны верхняя и нижняя поверхности лесов. Шкала баров: XY = 300 мкм, ZY = 100 мкм. D) SEM-изображение поперечного сечения целлюлозного каркаса после посева клеток C2C12, которым давали возможность пролиферировать в течение четырех недель. Клетки были окрашены в цифровом виде, чтобы увеличить контраст между клетками и структурой целлюлозы (Шкала шкалы: 50 мкм)

https://дои.org/10.1371/journal.pone.0097835.g004

Также было замечено, что большинство клеток находятся в тесно взаимодействующих агрегатах внутри отдельных полостей клеточной стенки. Для дальнейшего изучения пролиферации в структуре целлюлозы были созданы ортогональные виды объемных изображений. Зеленый (мембрана) и синий (ядро) сигналы видны внутри целлюлозной структуры, что свидетельствует о том, что клетки пролиферируют глубоко внутри каркасов. Флуоресцентные сигналы можно увидеть на глубине примерно 120 мкм от поверхности каркасов.Важно отметить, что потеря сигнала флуоресценции совпадает с пределом глубины изображения конфокального микроскопа. Следовательно, фактическая степень клеточной инвазии в каркас не может быть определена только с помощью конфокальной микроскопии. Для дальнейшего исследования степени клеточной инвазии в целлюлозные каркасы мы зафиксировали и дегидратировали (n = 3) нативные каркасы для визуализации с помощью СЭМ. Образцы были приготовлены таким образом, чтобы была видна внутренняя поверхность целлюлозных каркасов. Изображения SEM также показывают, что клетки могут мигрировать внутри каркасов.На рис. 4D мы представляем изображения клеток C2C12, которые мигрировали внутрь образца. Клетки четко видны внутри каркаса (рис. 4D) по сравнению с SEM незасеянного каркаса (рис. 2B). Клетки в каркасе можно увидеть прикрепленными к структуре целлюлозы, их морфология варьируется от круглой до распластанной, что согласуется с другими клетками млекопитающих, выращенными в других природных и синтетических 3D-каркасах [56]–[58].

Наконец, морфологию актинового цитоскелета также исследовали для всех типов клеток в немодифицированных целлюлозных каркасах (n = 3 для каждого типа клеток).В этом случае клетки культивировали только в течение 1 недели, так как актиновый цитоскелет легче разрешался в образцах с более низкой плотностью. Все типы клеток млекопитающих в каркасах демонстрируют четкие актиновые стрессовые волокна, соответствующие прочно прикрепленным клеткам, как показано на твердых 2D-субстратах [46], [47], [59] (рис. 5). Эти результаты демонстрируют, что клетки млекопитающих были хорошо прикреплены к каркасу из целлюлозы, а не просто были физически заключены внутри каркаса.

Рисунок 5.Фиксированные и окрашенные изображения клеток актинового цитоскелета, культивируемых в трехмерном целлюлозном каркасе.

A) NIh4T3, B) C2C12 и C) клетки HeLa культивировали на целлюлозных каркасах в течение 2 недель перед окрашиванием на актин (зеленый) и ядра клеток (синий). (. Клетки NIh4T3 и C2C12 демонстрируют характерные актиновые стрессовые волокна, обнаруженные в культивируемых клетках. Клетки HeLa также демонстрируют характерные актиновые структуры, включая меньшее количество заметных стрессовых волокон и большую локализацию актина в коре.Масштабная линейка = 25 мкм и применяется ко всем.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0097835.g005

Распространение и жизнеспособность

Для количественной оценки долгосрочной пролиферации и жизнеспособности клеток были получены конфокальные изображения всего целлюлозного каркаса через 1, 8 и 12 недель непрерывного культивирования клеток. Для оценки пролиферации конфокальные объемы клеточных ядер были получены в случайных местах на n = 3 каркасах, засеянных клетками NIh4T3, C2C12 или HeLa.Для каждого типа клеток было выбрано n = 3 случайно выбранных 1,6×10 ⁶ мкм ² областей визуализации, и была выполнена конфокальная визуализация. Было обнаружено, что глубина изображения, необходимая для захвата всех клеток в области образца, изменялась из-за того, что клетки со временем внедрялись глубже в каркас. Используя эти данные, были подсчитаны клетки, и было показано, что их количество увеличилось в несколько раз за 12-недельный период (фиг. 6А). Количество клеток HeLa и C2C12 увеличивалось с одинаковой скоростью, которая была выше, чем у клеток NIh4T3.Несмотря на это, все типы клеток демонстрировали трех-четырехкратное увеличение числа в течение 12-недельного периода непрерывного культивирования.

Рис. 6. Пролиферация и жизнеспособность клеток с течением времени.

A) Клетки NIh4T3, C2C12 и HeLa культивировали по отдельности в целлюлозных матрицах n = 3 в течение 1, 8 и 2 недель, а затем визуализировали с помощью конфокальной микроскопии после окрашивания Hoechst 33342. Клетки подсчитывали в каждый момент времени и увеличивали четко прослеживается клеточная популяция. B) Через 12 недель культивирования клетки C2C12 фиксировали и окрашивали Hoechst 33342 (синий: жизнеспособные клетки) и йодидом пропидия (PI) (красный: апоптотические/некротические клетки).Были получены конфокальные объемы и спроецированы в плоскости XY и ZY, и они показали, что клетки пролиферировали по всей структуре в течение 12-недельного культивирования. Апоптотические/некротические клетки находятся в более глубоких областях каркаса. Указаны верхняя и нижняя поверхности лесов. Было подсчитано количество живых (Hoechst(+)) и мертвых (Hoechst/PI(+)) клеток, и было обнаружено, что около 98% клеток внутри каркаса являются жизнеспособными. Данные показаны для клеток C2C12, но аналогичны для клеток NIh4T3 и HeLa (данные не показаны).Масштабная линейка: B = 200 мкм для XY и 100 мкм для ZY.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0097835.g006

Мы также исследовали жизнеспособность клеток в этих целлюлозных каркасах после 12 недель непрерывного культивирования. Каркасы (n = 3) инкубировали с йодидом пропидия и Hoechst 33342 для специфического мечения апоптотических/некротических или живых клеток соответственно (фиг. 6B). Во всех случаях Hoechst помечал все клеточные ядра (живые и мертвые) по всему образцу. Наоборот, йодид пропидия специфически пометил меньшинство мертвых клеток, которые в основном располагались ближе к внутренней части каркаса.Жизнеспособность клеток количественно определяли путем подсчета Hoescht-позитивных (живых) и PI/Hoescht-позитивных (мертвых) ядер клеток. Большинство клеток (98 ± 1% клеток C2C12), культивируемых на яблочном каркасе, были Hoechst-позитивными после 12 недель культивирования (рис. 6C) с идентичными результатами для других типов клеток (данные не показаны). Эти результаты продемонстрировали высокую степень жизнеспособности долговременных культур на поверхности этих целлюлозных каркасов. Ортогональные проекции показали, что небольшая популяция апоптотических/некротических клеток располагалась примерно в 120 мкм внутрь целлюлозного каркаса (см.6Б). Даже в областях с повышенной плотностью клеток целлюлозный каркас имел достаточную пористость, чтобы обеспечить перенос среды/питательных веществ внутрь каркаса.

Обсуждение

Клетки в 3D-среде, будь то искусственный внеклеточный матрикс или живые ткани, часто демонстрируют многочисленные морфологические и биохимические отличия от клеток, культивируемых на 2D-поверхности [8]. Эти различия находятся под пристальным вниманием, так как многие исследования продемонстрировали важность пространственных сигналов в ECM.Например, было показано, что геометрия и специальные сигналы влияют на морфологию клеток, передачу сигналов мРНК и дифференцировку [5], [9], [60]–[62]. Таким образом, использование трехмерных каркасов для культивирования клеток in vitro полезно для нашего фундаментального понимания клеточной биологии и, следовательно, имеет множество потенциальных применений. Однако разработка и использование трехмерных биосовместимых каркасов сопряжены с рядом проблем. Биоматериалы должны быть биосовместимыми, биоразлагаемыми, позволять модифицировать поверхность и быть экономически эффективными.Появились два метода производства. Первым из этих методов является использование искусственных каркасов, синтезированных из (био)полимеров. Преимущество искусственных каркасов заключается в том, что они обеспечивают исключительный контроль над материалом, позволяя настраивать биохимические и структурные свойства каркаса [63]–[67]. С другой стороны, децеллюляризация использовалась для создания естественных трехмерных каркасов из существующей ткани [13], [33], [44], [65]–[68]. Децеллюляризация использует различные реагенты для лизиса и удаления клеток из внеклеточного матрикса данного образца ткани [32], [34].Хотя в этом подходе отсутствует точный контроль над физическими и биохимическими свойствами каркаса, он приводит к легко полученному, естественно полученному каркасу, который используется при создании функциональных органов [33], [41]–[44].

Здесь показано, что децеллюляризованная ткань гипантия яблони обеспечивает несколько характеристик, которые желательны для создания трехмерных клеточных каркасов. Гипантий яблони в основном состоит из клеточных стенок растений, которые образуют пористую сеть полостей, в которых находятся растительные клетки [69].Эта пористая среда позволяет облегчить перенос питательных веществ по тканям. Кроме того, эта среда также идеально подходит для децеллюляризации, поскольку позволяет быстро обмениваться детергентами, буферами и средами без использования систем перфузии. Мы смогли быстро изготовить каркасы из децеллюляризованной целлюлозы, просто используя раствор детергента. Важно отметить, что фибробласты мыши (NIh4T3), мышечные миобласты мыши (C2C12) и эпителиальные клетки человека (HeLa) были способны полностью проникать, пролиферировать и оставаться жизнеспособными после длительного периода культивирования (12 недель) в целлюлозных каркасах.

Известно, что механические и биохимические свойства внеклеточного матрикса играют очень важную роль в управлении клеточной физиологией [5], [60]–[62]. Каркасы, полученные из яблочного гипантия, используемые в этом исследовании, состоят из целлюлозы, собранной в микрофибриллы, которые затем сшиты гемицеллюлозой [70] и напоминают пористую природу ВКМ. Здесь, используя АСМ, мы продемонстрировали, что локальный модуль Юнга каркаса может быть изменен посредством химической сшивки или биохимической функционализации.Мы обнаружили, что нативные образцы и образцы с ДСН не показали статистической разницы в локальном модуле Юнга ( p <0,05), демонстрируя, что обработка ДСН не изменяет механику структуры целлюлозы [31]. Кроме того, также было замечено, что каркасы, функционализированные коллагеном или сшитые глутаральдегидом, демонстрировали значительное двух-четырехкратное увеличение модуля Юнга ( p <0,001) по сравнению с нативными тканями или нефункционализированными децеллюляризованными каркасами.Наши результаты согласуются с предыдущими исследованиями, которые демонстрируют, что функционализация коллагена или сшивание глутаральдегидом имеет тенденцию к увеличению модуля Юнга биологических материалов [71]–[73]. Способность настраивать жесткость целлюлозного каркаса имеет решающее значение, поскольку давно установлено, что клетки предпочитают матрикс с определенной жесткостью для дифференцировки и приобретения своих специфических клеточных свойств [32], [34], [60], [69], [70]. . Таким образом, мы показали, что можно контролировать и модулировать механическую жесткость целлюлозного каркаса.

Предыдущие исследования с использованием испытаний на механическое сжатие объемных образцов яблок показали значительно более высокие измерения модуля Юнга в диапазоне МПа [74], [75] по сравнению с полученными в нашем исследовании. Их технические подходы измеряют эластичность, которая отражает силы, необходимые для деформации всех клеток и целлюлозных структур в большой области ткани яблока. В отличие от этого, мы использовали АСМ с модифицированным кантилеверным зондом, используя шарик коллоидного полистирола размером 10 мкм, чтобы исследовать локальную эластичность.Измерения модуля Юнга, полученные с помощью этого подхода, отражают локальную деформацию небольшой микромасштабной области целлюлозного каркаса. Из-за локального характера измерений АСМ измеренный модуль Юнга более точно отражает механические свойства клеток. Интересно, что в недавнем исследовании было определено, что локальный модуль Юнга ткани растения томата находится в том же порядке, что и наши измерения, ~ 7–29 кПа [76]. Эти результаты также были получены с использованием АСМ и модифицированного кантилевера с прикрепленным коллоидом 10 мкм.Однако важно то, что при всех условиях и при различных модулях Юнга наблюдали быстрый рост и пролиферацию клеток внутри целлюлозных каркасов.

Использование протокола окрашивания, установленного Truernit et al. [48], мы одновременно визуализировали структуру целлюлозы вместе с внедренными клетками. Изображения конфокальной микроскопии показали, что все три типа клеток, использованных в этом исследовании, были обнаружены на поверхностях и во внутренних полостях внутри целлюлозного каркаса.Клетки надежно визуализировались на глубину примерно 120 мкм ниже верхней поверхности каркаса. Во всех трех типах клеток мы также наблюдали присутствие отдельных F-актиновых стрессовых волокон, которые являются морфологической характеристикой клеток, прикрепленных к субстрату [47], [77], [78]. Как фибробласты, так и миобласты, культивируемые в наших матриксах, обладали ярко выраженными актиновыми стрессовыми волокнами, сходными с таковыми в тех же клетках, культивируемых на 2D-субстратах [46], [47]. Было обнаружено, что клетки HeLa экспрессируют кортикальный актин и актиновые стрессовые волокна.В этом случае стрессовые волокна были менее заметны, чем те, которые наблюдались в фибробластах и миобластах, однако наблюдаемая морфология актинового цитоскелета очень согласуется с клетками HeLa, культивируемыми на 2D-субстратах [78]. Результаты ясно демонстрируют, что все изученные здесь типы клеток были способны размножаться, демонстрируя сильное прикрепление к поверхностям целлюлозных каркасов.

Ограничением конфокальной микроскопии является ограниченная глубина, на которой можно получить изображение образца. Чтобы определить, мигрировали ли клетки млекопитающих внутрь каркаса, образец фиксировали, замораживали, а затем ломали перпендикулярно верхней поверхности.Этот процесс позволил нам получить изображение внутренней части целлюлозного каркаса с помощью СЭМ. В этом случае клетки C2C12 культивировали на каркасах и впоследствии визуализировали. Клетки были обнаружены глубоко внутри каркаса и обладали морфологией, которая была как округлой, так и плоской и распределенной вдоль поверхности целлюлозы, аналогично клеткам миобластов в других трехмерных средах [79], [80]. Интересно, что целлюлозный каркас появляется в коллапсированном/сжатом состоянии в присутствии клеток млекопитающих.Когда клетки млекопитающих отсутствуют в каркасе, такие морфологии не наблюдаются, что подтверждает, что подготовка к SEM-визуализации не вызывает этого эффекта. В настоящее время происхождение этого изменения в морфологии не совсем понятно, однако мы предполагаем, что оно может быть связано с наличием клеточных сил тяги, адсорбцией белков сыворотки на каркасе или клеточным ремоделированием/деградацией каркаса.

Для количественной оценки пролиферации мы подсчитали количество клеток, присутствующих в каркасах, через 1, 8 и 12 недель непрерывного культивирования in vitro .Во всех случаях наблюдали пролиферацию клеток и увеличение их числа в 3–4 раза. Однако было замечено, что клетки C2C12 и HeLa почти вдвое превышали количество клеток NIh4T3. Это интригующий результат, поскольку скорость удвоения NIh4T3, культивируемых на стекле (18 часов), немного ниже, чем у клеток HeLa (24 часа) [81], [82]. Анализы жизнеспособности также показывают, что высокий процент клеток оставался жизнеспособным даже после 12 недель непрерывного культивирования in vitro. Большинство апоптотических клеток располагалось внутри целлюлозного каркаса.Это, вероятно, вызвано отсутствием оборота среды, что приводит к недостаточному снабжению питательными веществами и кислородом, что является обычным явлением в 3D-моделях культуры [83]. 3D сфероидные клеточные культуры, которые часто содержат некротическое ядро клеток из-за недостаточного снабжения питательными веществами и кислородом [83].

Хотя результаты показывают, что клетки размножаются и остаются жизнеспособными в матриксах, их пористость может иметь важное влияние на наблюдаемые результаты. Высокая пористость лесов имеет как преимущества, так и недостатки.Высокая пористость каркаса позволяет клеткам проходить через материал без высокой степени удержания. Это приводит к низкой эффективности посева, что может быть проблемой в некоторых приложениях (культура редких клеток и т.д.). Например, в этом исследовании каждый каркас (общий объем ~1 мм ³) первоначально засевали с плотностью ~6×10 ⁶ клеток/мм ³ . Однако плотность клеток была ниже после 1 недели культивирования (~2×10 ⁶ клеток/мм ³) из-за потери клеток во время замены среды.Следовательно, требуется большое количество времени (12 недель), чтобы клетки медленно пролиферировали и заполнили весь каркас. Это неудивительно, учитывая проблемы, отмеченные выше, и тот факт, что эти клетки млекопитающих пролиферируют в каркасе, который состоит в основном из целлюлозы, а не из белков ECM. Несмотря на медленную пролиферацию, плотность клеток приближается к уровням, указанным в других биоматериалах [41], [43], [84]. Эффективность начального посева может быть улучшена за счет дальнейшей биохимической модификации или химического сшивания каркасов для увеличения потенциала связывания.Будущая работа будет посвящена изучению модификации лесов для контроля пористости и повышения эффективности засева. В качестве альтернативы, встречающаяся в природе целлюлоза с более низкой пористостью может быть обнаружена в других видах яблок или типах растений. Тем не менее, в будущих исследованиях будет изучено использование каркасов из целлюлозы более высокой плотности для повышения эффективности посева, что сократит время, необходимое для полного заполнения каркасов.

Кроме того, высокая пористость матриксов, вероятно, приводит к переоценке жизнеспособности клеток.Мертвые клетки можно легко смыть во время замены среды, что снижает наблюдаемое количество мертвых клеток в каркасе. Кроме того, ограниченная глубина, связанная с конфокальной микроскопией, также будет влиять на способность анализировать физиологическое состояние клеток глубоко внутри каркаса. Другие анализы жизнеспособности также затруднены из-за природы целлюлозного каркаса. В частности, анализ с трипановым синим проблематичен, поскольку краситель сильно взаимодействует с каркасом, что значительно затрудняет подсчет и количественную оценку клеток.

Хотя эти ограничения существуют, клетки млекопитающих явно способны к пролиферации, инвазии и обладают интактным актиновым цитоскелетом внутри каркасов. Во всех трех случаях наблюдалось тесное взаимодействие клеток друг с другом и с каркасом в больших сетях дальнего действия. Кроме того, эти целлюлозные каркасы представляют собой очень недорогой подход к изучению пролиферации и инвазии клеток в 3D. Эти целлюлозные биоматериалы отлично дополняют множество возможностей для изучения трехмерной клеточной биологии in vitro .Целлюлозные каркасы достаточно пористы, чтобы обеспечить эффективный обмен питательными веществами и газами, биосовместимы, легко функционализуются, а их механические свойства можно контролировать.

Выводы

Результаты, представленные в этом исследовании, естественно, вызывают вопросы о применимости целлюлозных каркасов in vivo. На данный момент еще слишком рано делать предположения, так как есть много неизвестных о биосовместимости этих каркасов in vivo . Иммунологический ответ и долговременная стабильность имплантированных биоматериалов на основе целлюлозы все еще изучаются [22], [85].Мы не рассматривали эти вопросы в этом исследовании, поскольку наша цель состояла только в том, чтобы продемонстрировать пригодность каркасов из целлюлозы, полученной из яблок, для поддержки культуры клеток млекопитающих in vitro . Доступны многочисленные подходы к созданию 3D-матриц, поддерживающих культуру клеток млекопитающих [86], однако многие из этих продуктов являются патентованными, дорогими или требуют химического синтеза. Каркасы из целлюлозы растительного происхождения предлагают альтернативный подход к 3D-культуре, предлагая преимущества простоты производства и модификации, снижения затрат и возможности изготовления целлюлозы в форме, характерной для пользователя.В совокупности наши результаты показывают, что натуральные каркасы из целлюлозы, полученной из яблок, могут быть получены с использованием обычных подходов к децеллюляризации и будут поддерживать трехмерную культуру клеток. Развившаяся пористость ткани гипантия яблони облегчает первоначальную децеллюляризацию и обеспечивает критический перенос среды, обеспечивая долгосрочную жизнеспособность клеток. Было обнаружено, что три типа клеток млекопитающих пролиферируют, мигрируют и остаются жизнеспособными в каркасах до 12 недель (максимальная продолжительность исследования).Кроме того, биохимическая функционализация или химическое сшивание также могут быть использованы для контроля биохимии поверхности и/или механических свойств каркаса. Преимущества этих целлюлозных каркасов делают их одним из нескольких потенциальных биоматериалов для трехмерной культуры клеток in vitro, доступных в настоящее время.

Благодарности

Авторы выражают благодарность доктору Юнь Лю за помощь в работе с изображениями СЭМ, Сафи Сайеду за щедрое пожертвование образцов для этого исследования и Тристану Мэтисону за помощь в подготовке фигур.

Вклад авторов

Идея и дизайн экспериментов: ДМ АЭП. Выполнены опыты: ДМ КЛ ЗАР. Проанализированы данные: DM AEP KH. Предоставленные реагенты/материалы/инструменты для анализа: DM CL ZAR KH. Написал статью: ДМ КЛ ЗАР Х АЭП.

Каталожные номера

1. Yamada KM, Cukierman E (2007) Моделирование морфогенеза тканей и рака в 3D. Сотовый 130: 601–610
2. Дерда Р., Ларомейн А., Маммото А., Тан СКИ, Маммото Т. и др.(2009)Поддерживаемая бумагой трехмерная культура клеток для биоанализа на основе тканей. ПНАС 106: 18457–18462
3. McBane JE, Sharifpoor S, Cai K, Labow RS, Santerre JP (2011)Биодеградация и биосовместимость in vivo разлагаемого полярного/гидрофобного/ионного полиуретана для применения в тканевой инженерии. Биоматериалы 32: 6034–6044
4. Haycock JW (2011) Трехмерная культура клеток: обзор современных подходов и методов. Методы Mol Biol 695: 1–15
5. Пушманн Т.Б., Занден С., Де Пабло Ю., Кирхгоф Ф., Пекна М. и соавт.(2013) Биоактивная система 3D-культивирования клеток сводит к минимуму клеточный стресс и поддерживает морфологическую сложность клеток астроглии, подобную in vivo. Глия 61: 432–440
6. Fennema E, Rivron N, Rouwkema J, VanBlitterswijk C, DeBoer J (2013)Культура сфероидов как инструмент для создания трехмерных сложных тканей. Trends Biotechnol 31: 108–115
7. Гриффит Л.Г., Шварц М.А. (2006) Захват сложной трехмерной физиологии тканей in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol 7: 211–224
8.Бейкер Б.М., Чен К.С. (2012) Деконструкция третьего измерения: как микроокружение трехмерной культуры изменяет клеточные сигналы. J Cell Sci 125: 3015–3024
9. Понтес Соареш С., Мидлей В., ДеОливейра М.Э.В., Бенчимол М., Коста М.Л. и др. (2012) 2D- и 3D-организованные сердечные клетки демонстрируют различия в клеточной морфологии, адгезионных соединениях, наличии миофибрилл и экспрессии белка. PLoS One 7: e38147
10. Petersen OW, Rønnov-Jessen L, Howlett AR, Bissell MJ (1992)Взаимодействие с базальной мембраной позволяет быстро различать характер роста и дифференцировки нормальных и злокачественных эпителиальных клеток молочной железы человека.Proc Natl Acad Sci U S A 89: 9064–9068.
11. VonDerMark K, Gauss V, VonDerMark H, Muller P (1977) Связь между формой клеток и типом коллагена, синтезируемого по мере того, как хрондроциты теряют свой хрящевой фенотип в культуре. Природа 267: 531–532.
12. Benya PD, Shaffer JD (1982)Дедифференцированные хондроциты реэкспрессируют фенотип дифференцированного коллагена при культивировании в агарозных гелях. Ячейка 30: 215–224.
13. Оуэн С.К., Шойхет М.С. (2010) Дизайн трехмерных биомиметических каркасов.J Biomed Mater Res A 94: 1321–1331
14. Терри Р.А., Тилли Дж.М.А., Оутен Г.Э. (1969) Влияние рН на переваривание целлюлозы в условиях in vitro. J Sci Food Agric 20.
15. Клемм Д., Шуман Д., Удхардт У., Марш С. (2001)Искусственные кровеносные сосуды из синтезированной бактериями целлюлозы для микрохирургии. Prog Polym Sci 26: 1561–1603.
16. Свенссон А., Никлассон Э., Харра Т., Панилайтис Б., Каплан Д.Л. и соавт. (2005)Бактериальная целлюлоза как потенциальный каркас для тканевой инженерии хряща.Биоматериалы 26: 419–431
17. Бекдал Х., Хелениус Г., Бодин А., Наннмарк У., Йоханссон Б.Р. и соавт. (2006)Механические свойства бактериальной целлюлозы и взаимодействие с гладкомышечными клетками. Биоматериалы 27: 2141–2149
18. Biomateriais D, Engenharia F De (2001)Фосфаты целлюлозы как биоматериалы. Минерализация химически модифицированных гидрогелей регенерированной целлюлозы. 6: 2163–2172.
19. Czaja WK, Young DJ, Kawecki M, Brown RM (2007) Будущие перспективы микробной целлюлозы в биомедицинских применениях.Биомакромолекулы 8: 1–12
20. Andrade FK, Silva JP, Carvalho M, Castanheira EMS, Soares R, et al. (2011) Исследования гемосовместимости бактериальной целлюлозы. J Biomed Mater Res 98: 554–566
21. Хираяма К., Окицу Т., Терамэ Х., Кирия Д., Оноэ Х. и др. (2013) Клеточная строительная единица, интегрированная с бактериальной целлюлозой в форме микронитей. Биоматериалы 34: 2421–2427
22. Шуманн Д., Випперманн Дж., Клемм Д.О., Крамер Ф., Кот Д. и соавт.(2008)Искусственные сосудистые имплантаты из бактериальной целлюлозы: предварительные результаты заменителей мелких артерий. Целлюлоза 16: 877–885
23. Дерда Р., Тан Скай, Ларомейн А., Мосадег Б., Хонг Э. и др. (2011) Многозонная бумажная платформа для трехмерных клеточных культур. PLoS One 6: e18940
24. Исихара К., Миядзаки Х., Куросаки Т.Н.Н. (1995)Улучшение совместимости крови на целлюлозной диализной мембране. 111. Синтез и характеристики водорастворимой целлюлозы с привитым фосфолипидным полимером в качестве материала покрытия на целлюлозной диализной мембране.J Biomed Mater Res 29: 181–188.
25. Ватанабэ К., Это Ю., Такано С., Накамори С., Шибай Х. и др. (1993)Новый субстрат из бактериальной целлюлозы для культуры клеток млекопитающих. Цитотехнология 13: 107–114
26. Пертиль РАН, Морейра С., Гил Р.М., Коррейя А., Гуардао Л. (2012) Бактериальная целлюлоза: долгосрочные исследования биосовместимости. J Biomater Sci Polym Ed 23: 1339–1354.
27. Entcheva E, Bien H, Yin L, Chung C-Y, Farrell M, et al. (2004) Функциональные сердечные клеточные конструкции на основе целлюлозы.Биоматериалы 25: 5753–5762
28. Клемм Д., Хойблейн Б., Финк Х.П., Бон А. (2005)Целлюлоза: увлекательный биополимер и устойчивое сырье. ‘Angewandte Chemie (международное издание на английском языке) 44: 3358–3393
29. Бэнкрофт Г.Н., Сикавицас В.И., Микос А.Г. (2003) Проектирование проточной перфузионной биореакторной системы для применения в области инженерии костной ткани. Ткань Eng 9.
30. Бургин П.Е., Пиппенджер Б.Е., Тодоров А., Чанг Л., Мартин И. (2013)Децеллюляризация тканей путем активации запрограммированной гибели клеток.Биоматериалы 34: 6099–6108
31. Gratzer PF, Harrison RD, Woods T (2006)Изменение матрикса, а не остаточная цитотоксичность додецилсульфата натрия влияет на клеточную репопуляцию децеллюляризированного матрикса. Tissue Eng 12: 2975–2983
32. Гиллис А.Р., Смит Л.Р., Либер Р.Л., доктор философии, Варгезе С. (2011) Метод децеллюляризации скелетных мышц без детергентов или протеолитических ферментов. 17.
33. Орландо Дж., Вуд К.Дж., Стратта Р.Дж., Ю Дж.Дж., Атала А. и др.(2011) Регенеративная медицина и трансплантация органов: прошлое, настоящее и будущее. Трансплантация 91: 1310–1317
34. Аренас-Эррера Дж. Э., Ко И. К., Атала А., Ю Дж. Дж. (2013) Децеллюляризация для биоинженерии целых органов. Биомед Матер 8: 014106
35. Гилберт Т.В., Селларо Т.Л., Бадылак С.Ф. (2006)Децеллюляризация тканей и органов. Биоматериалы 27: 3675–3683
36. Ридер Э., Казимир М.Т., Зильберхумер Г., Зеебахер Г., Вольнер Э. и др.(2004) Протоколы децеллюляризации клапанов сердца свиньи существенно различаются по эффективности удаления клеток и восприимчивости матрикса к рецеллюляризации сосудистыми клетками человека. J Thorac Cardiovasc Surg 127: 399–405
37. Казимир М.Т., Ридер Э., Зеебахер Г., Зильберхумер Г., Вольнер Э. и др. (2003) Сравнение различных процедур децеллюляризации клапанов сердца свиньи. Int J Artif Organs 26: 421–427.
38. Song JJ, Ott HC (2011)Инженерия органов на основе децеллюляризованных матричных каркасов.Trends Mol Med 17: 424–432
39. Шанер П.Дж., Мартин Н.Д., Туленко Т.Н., Шапиро И.М., Тарола Н.А., и соавт. (2004)Децеллюляризованная вена как потенциальный каркас для инженерии сосудистой ткани. J Vasc Surg 40: 146–153
40. Накаяма К.Х., Батчелдер К.А., Ли К.И., Тарантал А.Ф. (2010)Децеллюляризованная почка макаки-резус как трехмерный каркас для инженерии почечной ткани. Tissue Eng Часть A 16.
41. Отт Х.К., Маттисен Т.С., Гох С.К., Блэк Л.Д., Крен С.М. и др.(2008) Перфузионно-децеллюляризованная матрица: использование природной платформы для создания биоискусственного сердца. Nat Med 14: 213–221
42. Росс Э., Уильямс М.Дж., Хамазаки Т., Терада Н., Клапп В.Л. и др. (2009) Эмбриональные стволовые клетки пролиферируют и дифференцируются при посеве в каркасы почек. J Am Soc Nephrol 20: 2338–2347
43. Лу Т.И., Лин Б., Ким Дж., Салливан М., Тобита К. и др. (2013) Репопуляция децеллюляризованного сердца мыши индуцированными человеком плюрипотентными стволовыми клетками сердечно-сосудистых клеток-предшественников.Нац коммуна 4: 1–11
44. Атала А., Бауэр С.Б., Сокер С., Ю Дж. Дж., Ретик А. Б. (2006) Тканеинженерные аутологичные мочевые пузыри для пациентов, нуждающихся в цистопластике. Ланцет 367: 1241–1246
45. Ott HC, Clippinger B, Conrad C, Schuetz C, Pomerantseva I, et al. (2010)Регенерация и ортотопическая трансплантация биоискусственного легкого. Nat Med 16: 927–933
46. Гуолла Л., Бертран М., Хаазе К., Пеллинг А.Е. (2012)Силовая трансдукция и динамика деформации в актиновых стрессовых волокнах в ответ на наноньютонные силы.J Cell Sci 125: 603–613
47. Модулевский Д.Дж., Тремблей Д., Гуллексон С., Букорестлиев Н.В., Пеллинг А.Е. (2012)Физическое взаимодействие миобластов с микроокружением при ремоделировании цитоархитектоники. PLoS One 7: e45329
48. Truernit E, Bauby H, Dubreucq B, Grandjean O, Runions J и др. (2008) Полная визуализация с высоким разрешением трехмерной организации ткани и экспрессии генов позволяет изучать развитие и структуру флоэмы арабидопсиса.Plant Cell 20: 1494–1503
49. Хаттер Дж.Л., Беххофер Дж. (1993) Калибровка наконечников атомно-силового микроскопа. Rev Sci Instrum 64: 1868
50. Леви Р., Маалум М. (2002) Измерение жесткости пружины кантилеверов атомно-силового микроскопа: тепловые флуктуации и другие методы. Нанотехнологии 33.
51. Carl P, Kwok CH, Manderson G, Speicher DW, Discher DE (2001)Принудительное развертывание, модулируемое дисульфидными связями в доменах Ig молекулы клеточной адгезии.ПНАС 98: 1565–1570
52. Халбари Р.Л. (1944) Влияние воздушных пространств на трехмерную форму клеток стеблей элодеи и сравнение с сердцевинными клетками айлантуса. Am J Bot 31: 561–580.
53. Исав К. (1965) Анантомия растений. 2-е изд. Уайли.
54. Manduca A, Oliphant TE, Dresner MA, Mahowald JL, Kruse SA, et al. (2001) Магнитно-резонансная эластография: неинвазивное картирование эластичности тканей. Med Image Anal 5: 237–254.
55. Левенталь И., Жорж П.С., Джанми П. (2007)Мягкие биологические материалы и их влияние на функцию клеток. Мягкая материя 3: 299
56. Rai R, Keshavarz T, Roether J, Boccaccini A, Roy I (2011)Полигидроксиалканоаты со средней длиной цепи, перспективные новые биомедицинские материалы для будущего. Mater Sci Eng 72: 29–47
57. Fong ELS, Lamhammedi-Cherradi SE, Burdett E, Ramamoorthy V, Lazar AJ, et al. (2013)Моделирование опухолей саркомы Юинга in vitro с помощью трехмерных каркасов.ПНАС 110: 6500–6505
58. Дороти К., Раймунд Х., Юстус Б. (2011) Тканевая инженерия и регенеративная медицина. Эберли Д., редактор. дои: 10.5772/21197.
59. Пеллинг А.Е., Верайч Ф.С., Чу С.П.-К., Мейсон С., Хортон М. (2009)Механическая динамика одиночных клеток во время раннего апоптоза. Cell Motil Cytoskeleton 66: 409–422
60. Tee SY, Fu J, Chen C, Janmey P (2011) Форма клеток и жесткость субстрата регулируют жесткость клеток. Биофиз J 100: L25–7
61.Versaevel M, Grevesse T, Gabriele S (2012)Пространственная координация между формой клетки и ядра в эндотелиальных клетках с микроузором. Нацкоммуна 3: 671
62. Peng R, Yao X, Cao B, Tang J, Ding J (2012)Влияние условий культивирования на адипогенную и остеогенную индукцию мезенхимальных стволовых клеток на поверхностях с микроузором. Биоматериалы 33: 6008–6019
63. Фрид Л.Э., Гранде Д.А., Линбин З., Эммануэль Дж., Маркиз Дж.К. и др. (1994) Совместная шлифовка с использованием аллотрансплантата хондроцитов и синтетических биоразлагаемых полимерных каркасов.J Biomed Mater Res 28: 891–899
64. Тиббит М.В., Ансет К.С. (2009)Гидрогели как имитаторы внеклеточного матрикса для трехмерной культуры клеток. Biotechnol Bioeng 103: 655–663
65. Lutolf MP, Hubbell JA (2005)Синтетические биоматериалы как поучительные внеклеточные микроокружения для морфогенеза в тканевой инженерии. Nat Biotechnol 23: 47–55
66. Атала А., Ваканти Дж. П., Питерс К. А., Манделл Дж., Ретик А. Б. и соавт. (1992)Формирование уротелиальных структур in vivo из диссоциированных клеток, прикрепленных к биоразлагаемым полимерным каркасам in vitro.Дж. Урол 148: 658–662.
67. Фрид Л.Э., Маркиз Дж.К., Нория А., Эммануал Дж., Микос А.Г. и др. (1993) Формирование неохряща in vitro и in vivo с использованием клеток, культивируемых на синтетических биоразлагаемых полимерах. J Biomed Mater Res 27: 11–23
68. Бургин П.Е., Пиппенджер Б.Е., Тодоров А., Чанг Л., Мартин И. (2013)Децеллюляризация тканей путем активации запрограммированной гибели клеток. Биоматериалы 34: 6099–6108
69. Шаффнер Дж. Х. (1916) Общая система цветочных диаграмм.Огайо J Sci 16: 360–366.
70. Бретт С., Хиллман Дж. (1985) Биохимия клеточных стенок растений. Нью-Йорк: Издательство Кембриджского университета.
71. Хансен П., Хассенкам Т., Свенссон Р.Б., Аагард П., Траппе Т. и др. (2009)Сшивка сухожилия глутаральдегидом — механические эффекты на уровне сухожильного пучка и фибриллы. Connect Tissue Res 50: 211–222
72. Хаттер Дж.Л., Чен Дж., Ван В.К., Униял С., Леабу М. и др. (2005) Исследование атомно-силовой микроскопии зависимости клеточных упругих модулей от фиксации глутаральдегидом.J Microsc 219: 61–68
73. Ou K-L, Chung R-J, Tsai F-Y, Liang P-Y, Huang S-W и др. (2011) Влияние коллагена на механические свойства гидроксиапатитовых покрытий. J Mech Behav Biomed Mater 4: 618–624
74. Гротте М., Дюпра Ф., Пьетри Э., Лунис Д. (2002) Модуль Юнга, коэффициент Пуассона и коэффициенты Ламе золотого вкусного яблока. Int J Food Prop 5: 333–349
75. Масуди Х., Табатабаифар А., Боргаи А.М. (2007)Определение влияния хранения на механические свойства яблок с использованием теста на одноосное сжатие.Can Biosyst Eng 49: 29–33.
76. Здунек А., Куренда А. (2013)Исследование механических свойств растительных клеток с помощью атомно-силового микроскопа. Внутренний Симп.
77. Калдервуд Д., Шаттил С., Гинзберг М. (2000)Интегрины и актиновые филаменты: взаимная регуляция клеточной адгезии и передачи сигналов. J Biol Chem 275: 22607–22610
78. Хаазе К., Пеллинг А.Е. (2013)Устойчивость плазматической мембраны и актиновой коры к крупномасштабной деформации.
79.Chang H, Wang Y (2011) Реакция клеток на поверхность и архитектура каркасов тканевой инженерии. Regen Med Tissue Eng Cells Biomater.
80. McBane JE, Ebadi D, Sharifpoor S, Labow RS, Santerre JP (2011)Дифференциация моноцитов на разлагаемом, полярном, гидрофобном, ионном полиуретане: двумерные пленки и трехмерные каркасы. Acta Biomater 7: 115–122
81. Тодаро Г., Грин Х. (1963) Количественные исследования роста клеток Moyse Enbryo в культуре и их развития в установленные линии.J Cell Biol 17: 299–313.
82. Нильсен Т.В. (2013) Приготовление ядерных экстрактов из клеток HeLa. Протокол Cold Spring Harb 2013: 579–583
83. Милотти Э., Чиньола Р. (2010)Эмерджентные свойства микроокружения опухоли в реальной модели многоклеточных опухолевых сфероидов. PLoS One 5: e13942
84. Уйгун Б.Е., Сото-Гутьеррес А., Яги Х., Изамис М.Л., Гузарди М. и др. (2010) Реинжиниринг органов путем разработки трансплантируемого рецеллюляризованного трансплантата печени с использованием децеллюляризованного матрикса печени.Nat Med 16: 814–820
85. Андраде Ф., Александр Н., Аморим И., Гартнер Ф., Маурисио С. и др. (2012) Исследования биосовместимости бактериальной целлюлозы. J Bioact Compat Polym 28: 97–112
86. Страница H, Flood P, Reynaud EG (2013) Трехмерные культуры тканей: текущие тенденции и не только. Соотношение клеточной ткани 352: 123–131