Терминатор раскраски: Раскраски Терминатор скачать и распечатать бесплатно

🎨 терминатор из шоу грузовиков монстров

Какие преимущества для здоровья дают страницы с раскраской?

И дети, и родители могут извлечь выгоду из того, чтобы провести время, раскрашивая красивые и развлекательные страницы раскраски. Стресс — это основной фактор, который влияет на всех, как детей, так и взрослых, и, к счастью, раскраска может снизить стресс. Тем не менее, пришло время взять в руки мелки, цветные карандаши и маркеры и начать делать что-то полезное и творческое!

Красота ПАГИ ХЕЛП СКОРОСТЬ И УСТОЙЧИВОСТЬ

Если вы не знали, раскраска расслабляет миндалину, которая является центром страха в мозгу. Приступая к окрашиванию, любой человек переходит в состояние медитации, так как ум уменьшает количество мыслей, вызывающих стресс. После тяжелого, долгого дня в школе или на работе, состояние тишины и внимательности позволяет каждому человеку отдохнуть, делая что-то на самом деле.

Цветные бледнолицые бледнолицые бледнолицые бледнолицые бледнолицые бледнолицые бледнолицые бледнолицые бледнолицые бледнолицые бледнолицые

При раскраске весь ваш мозг начинает требовать связи между двумя полушариями, которые есть у мозга. Таким образом, окрашивание — это больше, чем просто развлечение, оно на самом деле является частью релаксации. Когда ребенок пытается оставаться внутри линий, его логика вступает в действие, но в то же время, когда нужно выбрать правильные цвета, рождается творческий мыслительный процесс. Итак, вот оно: Логика + Творчество = Великое время для ума.

Цветные бледнолицые плиты МОГУТ БЫТЬ АКТУАЛЬНО УДОБРЕННЫМ СЛАЙПом

Дети и взрослые в настоящее время, как правило, проводят так много часов ежедневно с использованием электроники. Это что-то не так, особенно если это делается ночью, из-за сильного воздействия электроники (гаджеты, смартфоны и т.д.) испускают свет, который снижает количество мелатонина, который является гормоном сна. Поэтому, отложите любой гаджет в сторону, особенно ночью, и дайте себе или вашему ребенку красивую раскраску, и вы будете лучше спать, а на следующий день все будут свежи.

КОНЦЕНТРАЦИЯ УДОВЛЕТВОРЕНИЯ ЦВЕТНЫХ ПАГ (ФОКУС)

Окрашивание требует большой концентрации, но не настолько, чтобы оно вызывало стресс. Ваша лобная доля открыта (именно она контролирует решение проблем и организацию деятельности мозга) и позволяет детям или взрослым наслаждаться моментом, сосредоточиться на задаче раскрашивания. Многие из вас скажут: но я не эксперт в раскраске. Вы ошибаетесь: не обязательно быть экспертом по раскраске, а просто наслаждаться прекрасным моментом, который поможет вам забыть о повседневных проблемах и начать думать о себе. Дети — это маленькие версии нас, поэтому они чувствуют стресс так же сильно, как мы помогаем вашим маленьким людям снять стресс и использовать свое свободное время, делая что-то полезное, расслабляющее и творческое. Это настоящий образовательный метод, который Вы должны использовать в воспитании и обучении Ваших детей.

Что символизирует цвет?

Каждый цвет означает что-то, или лучше сказать, символизирует что-то на психологическом уровне. Зная, что означает каждый цвет, вы лучше поймете душевное состояние человека, который окрасил что-то. Давайте погрузимся в значение наиболее используемых цветов при раскраске красивых раскрашенных страниц.

ЧЕРНЫЙ ЦВЕТ

Положительные значения черного цвета: защита, сильный, формальный, утонченный, окончания и начала, таинственный, комфорт, содержащиеся. Негативными значениями черного цвета являются: скрытный и скрытный, консервативный и серьезный, власть и контроль, грусть и негативность, отстраненность, депрессивность, пессимизм.

Цвет белый

. Положительными значениями цвета белого являются: невинность, чистота, чистота, равенство, простота, непорочность и опрятность, самодостаточность, первозданность и открытость, новые начинания, полнота и цельность. Положительные значения цвета белого: суровый, прихотливый, изолированный, простой, далекий, невообразимый, критичный и скучный, пустой, осторожный.

СИНИЙ ЦВЕТ

. Положительные значения голубого цвета: доверие и честность, тактичность, надежность, ответственность, консерватизм и настойчивость, верность, забота и забота, идеализм, порядок, авторитет, преданность и созерцательность, спокойствие и умиротворение. Отрицательные значения синего цвета: жесткий, подавленный и грустный, слишком пассивный, самодовольный, суеверный и эмоционально неустойчивый, лживый, злобный, консервативный или даже старомодный, предсказуемый, слабый, непрощающий, отстраненный и фригидный. Это также может указывать на манипуляцию, неверность и ненадежность.

COLOR GREEN

Цвет желтый

. Положительные значения желтого цвета: оптимизм, энтузиазм, веселье, уверенность, оригинальность, креативность, доброжелательность, академическая и аналитическая, мудрость, логика, сложность. Отрицательные значения желтого цвета: критическое, осуждающее, чрезмерно аналитическое, нетерпеливое, импульсивное, эгоистичное, пессимистическое, комплекс неполноценности, злобное, трусливое, обманчивое, неэмоциональное и лишенное сострадания.

COLOR ORANGE

. Положительные значения цвета оранжевого: оптимистичный, восторженный, жизнерадостный, уверенный в себе, независимый, яркий, общительный, экстравертный и несдерживаемый, авантюрный, рискованный, творческий талант, теплое сердце, приятный или даже неформальный. Отрицательные значения цвета оранжевого: поверхностный, неискренний, зависимый, переносный, снисходительный, пессимистичный, недорогой, необщительный, гордый.

Цвет красный

. Положительные значения красного цвета: действие, энергия, скорость, внимание, уверенный в себе, напористый и уверенный, энергичный, мощный, страстный, целеустремленный, смелый, сильный, спонтанный, целеустремленный. Отрицательные значения красного цвета: доминирующий, переносящий, утомительный, злой и быстродействующий, безжалостный, страшный, нетерпимый, агрессивный, бунтарский и упрямый, обидчивый.
.

Цветное золото

Положительные значения цвета золота включают в себя: изобилие, богатство, понимание, самоуважение, мудрость, сострадание, любовь, успех, страсть, харизматичность, победу, оптимизм, позитив. Отрицательные значения цвета включают в себя: эгоцентричный, требовательный, средний энергичный, отсутствие доверия, фальшь, страх успеха, страх богатства.

Цветной СЕРЕБОК

. Положительные значения цвета серебра: освещение, отражение, женская сила, балансировка, успокаивающее, успокаивающее, гламурное, самоконтроль, ответственность, организация, проницательность, мудрость, современный, гладкий, высокотехнологичный и научный, достоинство. Отрицательные значения цвета серебра: скучный, одинокий, безжизненный, бесцветный, жесткий, негативный, нейтральный, нерешительный, неискренний, обманчивый, меланхоличный.

Цвет серебряный

. Положительные значения цвета серого часто бывают: консервативный, достойный, нейтральный, беспристрастный, профессиональный, умный, классический, солидный, стабильный, успокаивающий, сдержанный, элегантный, формальный и надежный, надежный. Отрицательные значения цвета серого включают: нерешительные, неэмоциональные, безразличный, скучный, печальный, депрессивный, одинокий, изолированные

COLOR БРУУН

Положительные значения цвета коричневого: полезный, практичный, доступный, дружелюбный, стабильный, поддерживающий, утешительный, надежный, защитный, прочный, структурированный, спокойно уверенный, приземленный, чувствительный, теплый, успокаивающий, честный, искренний, качественный. Отрицательные значения коричневого цвета: скучный, скучный, бережливый, материалистичный, отсутствие юмора, отсутствие изысканности, дешевый и скупой, предсказуемый.

Цвет Магента

. Положительные значения пурпурного цвета: эмоциональное равновесие, помогает нашему духу парить, духовное, но практичное, вселенская гармония и любовь, здравый смысл, любящий, сострадательный, поддерживающий, добрый, творческий, изобретательный, новаторский, творческий и художественный, нонконформист, переговорщик. Отрицательные значения пурпурного цвета: импульсивный, властный, нетерпеливый, нетерпимый, избегает трудностей, слишком расслабляющий, чувствуя себя оторванным от других, властный или требовательный.

Цветной ПИНК

. Положительные значения цвета розового: безусловная любовь, сострадание, понимание, воспитание, романтика, теплота, надежда, успокаивающая, сладкая, женственная и интуитивная энергия. Отрицательные значения цвета розового: излишне эмоциональный и излишне осторожный, эмоциональная нужда или нереалистичные ожидания, физическая слабость, наивность, отсутствие силы воли и отсутствие самоценности.

Цветной ТУРКВИОЗ

. Положительные значения цвета бирюзы: ясность мысли, равновесие, гармония, идеализм, спокойствие, общение, творчество, сострадание, исцеление, самодостаточность. Отрицательными значениями цвета бирюзы являются: скрытность, ненадежность и сдержанность, скупердяйство, отчужденность, обман, хвастовство, неразборчивость в средствах.

ЦЕЛЬ ЦВЕТА

. Положительные значения цвета пурпурный: творческий и изобретательский, психический или интуитивный, гуманитарный, бескорыстный или безграничный, загадочный, фантастический и будущий, необычный, индивидуальный. Отрицательные значения пурпурного цвета: незрелость, непрактичность, циничность и отчуждённость, напыщенность или надменность, мошенничество или коррумпированность, мания величия, социальный скалолаз.
Теперь, когда вы знаете, что символизирует каждый цвет, вы будете знать, какой цвет использовать, и вы наверняка лучше поймете, какие чувства вы или ваш ребенок испытывает в тот момент, когда вы берете карандаш в руки и начинаете раскрашивать.

.

Прозрачные советы и хитрости использования готовых раскрасочных страниц

. Держите раскрашенные страницы ваших детей в папке в качестве воспоминаний
. Сделайте конверт из раскрасочной страницы
. Сделать вкладыши для конвертов.
Украсьте обычные подарочные пакеты
Сделать подарочную коробку
Превратите страницы с раскраской в закладки
. Разработайте свой собственный чехол для телефона
Производить магниты
Положите свои страницы с раскраской на стену
. Сделать пакеты с семенами
Есть много ремесел учебники онлайн, которые вы можете использовать.

Indian Indian Chief – вождь круизеров

Indian Chief (в переводе «вождь») – еще один культовый мотоцикл в американской мотоистории. Появился он

в 1922 году как увеличенная версия Скаута с мотором большей мощности – 1000 см³. Однако стал весьма самодостаточной моделью, пошел по своему, отдельному пути развития: год спустя он обзавелся новым, еще более мощным мотором – 1200 см³ – и коляской, назвался Big Chief и стал одним из самых продаваемых мотоциклов в отрасли. В 1940-м спутать эту модель с другой стало вовсе невозможно: новая модифицированная рама с ​​поршневой задней подвеской, вилка гирдер, спицованные колеса с белой окантовкой, большие и массивные крылья-юбки, ставшие фирменным отличительным знаком Indian…

 

Как известно, во время войны компания Indian Motorcycle производила и поставляла союзникам по Ленд-лизу армейские модели мотоциклов. Одна из них – 340-B – была создана на базе Chief, имела некрупные крылья и поставлялась, в основном, с коляской. Chief производился и продавался вплоть до 1953 года, когда компания объявила себя банкротом.

В 1998 году, после длительного затишья, когда завод не выпускал оригинальных мотоциклов, а владельцы менялись один за другим, все же появились первые ощутимые попытки возродить бренд, и возрождение это началось именно с модели Chief с двигателем S&S (1442 см³) и дизайном, основанным на легендарном Chief 1940-х годов. Этот байк выпускался на протяжении пяти лет.

Тут стоит рассказать об одном очень интересном факте: в 2003 году Indian Chief снялся в фильме «Терминатор 3: Восстание машин». В сцене эффектной погони Терминатора на полицейском байке роль полицейского байка поручена Indian Chief! На мотоцикл, разумеется, «надели форму» и предоставили возможность показать себя.

А вот и единственный сохранившийся после съемок экземпляр. К слову, всего для фильма было модифицировано восемь серийных мотоциклов, семь из которых принесены в жертву киноискусству – разбиты в каскадерских сценах.

 

В честь съемок в культовом фильме компания Indian выпустила лимитированную серию (всего 50 экземпляров) эффектных Chief T3, на каждый из которых была вручную нанесена графика, отражающая «горячий» характер фильма. Одной из особенностей этой серии стала короткая выхлопная труба, чей «лебединый» изгиб гармонирует с изогнутыми крыльями-юбками. На трубе нет глушителя, явно лишнего в этой идиллии, однако ездить без глушителя по дорогам запрещено, поэтому покупателям предлагалась стандартная выхлопная система Chief и короткая труба в качестве дополнения. От своего прототипа Chief T3 отличается, помимо уникальной раскраски, кожаным сиденьем ручной работы, твердыми кофрами, гравировкой на кожухе сцепления и табличкой, подтверждающей аутентичность образца.

Далее случился пятилетний период простоя. В 2008-2011 годах завод, попав в руки лондонской компании Stellican Ltd., снова запустил производство, и снова это был «вождь» – Stellican Indian Chief с 1720-кубовым двигателем V-twin.

В 2011 году, когда корпорация Polaris приобрела Indian, первым на конвейер встал тоже Chief. С этого момента и началась новая жизнь легендарной американской марки.

Chief Vintage поистине достоин был стать первым: отличительные черты в виде плавных линий классических крыльев, скрывающих полколеса, габаритного огня «war bonnet» в форме головы индейского вождя, стильных кожаных кофров с бахромой делают Chief действительно похожим на яркого «ортодоксального индейца». После него свет увидел брутальный и лаконичный Indian Chief Classic.

Производство Chief Vintage продолжалось вплоть до 2020 года. Его дизайн полностью отвечает названию: этот круизер выглядит так, будто сошел со страниц исторической хроники. Основательный, приземистый, устойчивый, тяжелый – он готов невозмутимо мчать хоть на край света. Традиционные крылья с «юбками», двигатель, стилизованный под старый V-твин с плоскими головками и боковыми клапанами, кожаные сиденья и кофры со съемной (на всякий случай) бахромой как изюминка стиля – все это делает образ цельным и завершенным.

Таким образом, несмотря на многократную смену владельцев компании, семейство мотоциклов Chief в том или ином виде всегда было частью модельного ряда Indian cо дня выпуска первого Chief в 1922 году.

Терминатор с сединою на висках – Деньги – Коммерсантъ

Как и было обещано, он вернулся — на мировых экранах снова «Терминатор». В главной роли сам железный Арни, а режиссер — Алан Тейлор, один из самых востребованных в телемире специалистов, за плечами у которого «Клан Сопрано», «Секс в большом городе» и «Игра престолов».

ВЛАДИМИР БОРОВОЙ

Из всех культовых кинофраншиз у «Терминатора», возможно, самая заковыристая судьба. Компания Halcyon, изначальный правообладатель, почти сразу после выхода четвертой части «Да придет спаситель» в 2009-м попала в переплет. Ее руководителей заподозрили в мошенничестве со средствами инвестиционного фонда, финансировавшего свежую картину, а саму компанию обанкротили. Права на «Терминатора» выставили на аукцион; за вкусный лот рубились такие мейджоры, как Universal и Sony, но в итоге он достался Меган Эллисон — весьма влиятельной фигуре в киномире, главе компании Annapurna Pictures. Эллисон передала производство фильма своему брату Дэвиду, на Skydance Productions (так как Annapurna массовым кино не занимается), оставшись одним из главных продюсеров картины. Единственная крупная студия, допущенная к проекту,— Paramount, с ней Меган Эллисон подписала контракт о дистрибуции. Более того, стороны успели договориться, что нынешний «Терминатор» непременно станет трилогией, и ее съемки должны быть завершены до 2019 года — именно тогда права на всю историю вернутся ее автору, Джеймсу Кэмерону.

Сам Кэмерон впервые за долгие годы внес в работу над «Терминатором» заметный вклад. Сценаристы и продюсеры не раз с ним встречались, и маститый специалист как минимум подкинул им блестящую идею, что плоть, которой покрыты сияющие металлические кости терминаторов, может стареть, как у обычных людей. Это позволило ловко обосновать появление в кадре седого Шварценеггера (кстати, седина натуральная). И вообще, Кэмерон создателей «Генезиса» фактически благословил, не раз отметив в интервью, что считает нынешнюю постановку наиболее близкой двум его собственным тематическим опытам. Косвенным подтверждением этих слов является то, что экс-губернатор Калифорнии согласился на участие в проекте только после того, как прочел сценарий и «нашел его отлично написанным». Актер ради роли начал интенсивные (насколько позволяет возраст) тренировки и за полгода вернул себе мышечную массу 12-летней давности — как на съемках третьей части франшизы.

Когда важные участники проекта демонстрируют такую вовлеченность, а мейджор позволяет пустить кусок 170-миллионного бюджета на то, чтобы раскрасить действие, происходящее в 1984 году, под цветовую гамму исходного «Терминатора», хочется верить, что картину ждет успех, крупные суммы в кассе и признание кинокритиков. Единственным препятствием здесь видится не самый простой сюжет фильма. Создатели, руководствуясь благородной целью оживить интригу во франшизе, придумали историю, в которой происходят неоднократные перемещения во времени, разделения временных потоков и прочие штуки, характерные для хардкорной научной фантастики. Запутаться в том, кто к кому в какое время прилетел, можно уже на уровне синопсиса. Остается надеяться, что в развернутом изложении все встанет на свои места и проект займет достойное место в пятерке самых кассовых фильмов про путешествия во времени, составленной для чистоты картины без других «Терминаторов».

Программой-минимум для Алана Тейлора со товарищи может стать победа над очевидными участниками топ-5 — работами Роберта Земекиса «Назад в будущее». Второй выпуск этой франшизы добрался до пятого места и удерживает его со следующими результатами: бюджет $40 млн, сборы $332 млн (третий по заработкам фильм 1989 года — после «Бэтмена» и третьего «Индианы Джонса»), коэффициент кассового успеха (ККУ) 8,3. Сценаристы «Генезиса» между прочим упоминали в качестве одного из источников вдохновения сюжетный ход с появлением Марти Макфлая в альтернативной ветке настоящего, где его родным городом заправляет злодей Бифф Таннен. Первый фильм «Назад в будущее», настоящий прорыв 1985 года и объект массового поклонения, на данный момент добрался до третьего места с $392 млн сборов, а благодаря микроскопическому бюджету ($19 млн) может похвастаться лучшим ККУ в пятерке: 20,6 пункта.

Между двумя историями про американского школьника в разных исторических эпохах затесался представитель другой великой франшизы — «Звездный путь», снятый Дж. Дж. Абрамсом в 2009 году. В нем, если кто вдруг забыл, путешествие во времени совершал вулканиец Спок — в определенный момент это позволило ему встретиться с самим собой лицом к лицу и оказать себе очень своевременную помощь. У перезапуска «Звездного пути» был немаленький бюджет — $150 млн, заработать же получилось $385,7 млн. ККУ не самый богатырский — 2,57, но его хватило, чтобы Paramount, которой принадлежат киноправа на вселенную Star Trek, раскошелилась на сиквел, и она не прогадала.

Второе место в топ-5 у третьей части «Людей в черном» Барри Зонненфельда — заметьте, еще одна франшиза. В картине действие параллельно развивается в 2012 и 1969 годах, а главный антагонист, межгалактический уголовник Борис Животное, убивает одного из главных героев в прошлом, меняя настоящее. Фильм порадовал критиков и отлично выступил в прокате: при бюджете $215 млн заработал $624 млн (ККУ 2,9) и открыл дорогу четвертой части «Людей в черном», в которой, возможно, появится сын Уилла Смита — Джейден.

Возглавляет рейтинг кассовых перемещений во времени последний релиз франшизы «Люди Икс», известный под заголовком «Дни минувшего будущего» и снятый Брайаном Сингером, где опять же не обошлось без контактов между старыми и юными версиями одних и тех же героев. Фильм стоимостью $200 млн собрал некислые $748,1 млн и показал ККУ 3,7. Сиквел, понятно, уже в работе, он должен выйти в 2016 году.

Раскраска Спецтехника — vkbobrov.ru


Warning: SQLite3::querySingle(): Unable to prepare statement: 1, no such table: pages in /home/admin/web/durgeeen0801. ru/public_html/index.php on line 1494

Notice: Trying to get property of non-object in /home/admin/web/durgeeen0801.ru/public_html/index.php on line 1518

Раскраска Спецтехника — vkbobrov.ru

Ваши покупки

АбаканАзовАлександровАлексинАльметьевскАнапаАнгарскАнжеро-СудженскАпатитыАрзамасАрмавирАрсеньевАртемАрхангельскАсбестАстраханьАчинскБалаковоБалахнаБалашихаБалашовБарнаулБатайскБелгородБелебейБеловоБелогорскБелорецкБелореченскБердскБерезникиБерезовскийБийскБиробиджанБлаговещенскБорБорисоглебскБоровичиБратскБрянскБугульмаБуденновскБузулукБуйнакскВеликие-ЛукиВеликий-НовгородВерхняя-ПышмаВидноеВладивостокВладикавказВладимирВолгоградВолгодонскВолжскВолжскийВологдаВольскВоркутаВоронежВоскресенскВоткинскВсеволожскВыборгВыксаВязьмаГатчинаГеленджикГеоргиевскГлазовГорно-АлтайскГрозныйГубкинГудермесГуковоГусь-ХрустальныйДербентДзержинскДимитровградДмитровДолгопрудныйДомодедовоДонскойДубнаЕвпаторияЕгорьевскЕйскЕкатеринбургЕлабугаЕлецЕссентукиЖелезногорскЖелезногорскЖигулевскЖуковскийЗаречныйЗеленогорскЗеленодольскЗлатоустИвановоИвантеевкаИжевскИзбербашИркутскИскитимИшимИшимбайЙошкар-ОлаКазаньКалининградКалугаКаменск-УральскийКаменск-ШахтинскийКамышинКанскКаспийскКемеровоКерчьКинешмаКиришиКировКирово-ЧепецкКиселевскКисловодскКлинКлинцыКовровКогалымКоломнаКомсомольск-на-АмуреКопейскКоролевКостромаКотласКрасногорскКраснодарКраснокаменскКраснокамскКраснотурьинскКрасноярскКропоткинКрымскКстовоКузнецкКумертауКунгурКурганКурскКызылЛабинскЛениногорскЛенинск-КузнецкийЛесосибирскЛипецкЛискиЛобняЛысьваЛыткариноЛюберцыМагаданМагнитогорскМайкопМахачкалаМеждуреченскМелеузМиассМинеральные-ВодыМинусинскМихайловкаМихайловскМичуринскМоскваМурманскМуромМытищиНабережные-ЧелныНазаровоНазраньНальчикНаро-ФоминскНаходкаНевинномысскНерюнгриНефтекамскНефтеюганскНижневартовскНижнекамскНижний-НовгородНижний-ТагилНовоалтайскНовокузнецкНовокуйбышевскНовомосковскНовороссийскНовосибирскНовотроицкНовоуральскНовочебоксарскНовочеркасскНовошахтинскНовый-УренгойНогинскНорильскНоябрьскНяганьОбнинскОдинцовоОзерскОктябрьскийОмскОрелОренбургОрехово-ЗуевоОрскПавловоПавловский-ПосадПензаПервоуральскПермьПетрозаводскПетропавловск-КамчатскийПодольскПолевскойПрокопьевскПрохладныйПсковПушкиноПятигорскРаменскоеРевдаРеутовРжевРославльРоссошьРостов-на-ДонуРубцовскРыбинскРязаньСалаватСальскСамараСанкт-ПетербургСаранскСарапулСаратовСаровСвободныйСевастопольСеверодвинскСеверскСергиев-ПосадСеровСерпуховСертоловоСибайСимферопольСлавянск-на-КубаниСмоленскСоликамскСолнечногорскСосновый-БорСочиСтавропольСтарый-ОсколСтерлитамакСтупиноСургутСызраньСыктывкарТаганрогТамбовТверьТимашевскТихвинТихорецкТобольскТольяттиТомскТроицкТуапсеТуймазыТулаТюменьУзловаяУлан-УдэУльяновскУрус-МартанУсолье-СибирскоеУссурийскУсть-ИлимскУфаУхтаФеодосияФрязиноХабаровскХанты-МансийскХасавюртХимкиЧайковскийЧапаевскЧебоксарыЧелябинскЧеремховоЧереповецЧеркесскЧерногорскЧеховЧистопольЧитаШадринск

Please enable JavaScript to view the comments powered by Disqus. vkbobrov.ru — Каталог цен и описаний на компьютерную и бытовую технику, товары для офис и дома, электронику, товаров для сада и дачи. Мы занимаемся поиском лучших цен в интернет магазинах по всей России, знаем где купить Раскраска Спецтехника по оптимальной цене в онлайн-магазинах. На нашем сайте vkbobrov.ru предоставлена вся необходимая информация для правильной покупки Раскраска Спецтехника — фотографии товаров, отзывы пользователей, поиск по модели и производителю, наименованию или модели, инструкции по эксплуатации, а так же экспертные обзоры, сайты предлагающие покупу онлайн с доставкой заказа в ваш город.
Notice: Undefined offset: 1 in /home/admin/web/durgeeen0801.ru/public_html/index.php on line 1950

«Терминатор-2»: день приемки | Статьи

Боевая машина поддержки танков (БМПТ) «Терминатор-2» будет принята на вооружение в ближайшее время, сообщил «РИА Новости» информированный источник в оборонной промышленности. О том, как эта машина более 30 лет пыталась попасть «в ряды» российских Вооруженных сил, — в материале iz.ru.

«Принципиальное решение [о взятии на вооружение] принято. В ближайшее время ожидается подписание соответствующих документов», — сообщил источник.

Танкохранитель

Опыт первых боев в Афганистане показал, что военным остро не хватает средства обеспечения для танков, способного эффективно подавлять живую силу противника, вооруженную ручными противотанковыми средствами. В особенности это касалось действий в горной местности, где зачастую требовался значительный угол возвышения для оружия. В тот момент даже появилось выражение «горный танк».

Фото: ИЗВЕСТИЯ/Михаил Терещенко

В отсутствие такого средства применялись БМП-2 (с ее 30-мм автоматической пушкой 2А42 с большим углом возвышения), а также штатная зенитная самоходная установка ЗСУ-23-4 со счетверенной 23-мм пушкой. Хорошие результаты — но только при обороне стационарно оборудованных позиций — показывала и буксируемая установка ЗУ-23-2 (спаренная 23-мм пушка). Однако это были паллиативы.

ПОДРОБНЕЕ ПО ТЕМЕ

В то же самое время в Советском Союзе прорабатывались концепции тяжелой БМП на танковом шасси — с защитой, как у танка (из-за возросшего насыщения переднего края прорываемой обороны противотанковыми средствами), и с вооружением, «почти как у танка». По одной из версий, исходно аббревиатура БМПТ и означала «боевая машина пехоты тяжелая».

В середине 1980-х все эти соображения выкристаллизовались в концепцию специальной тяжелой боевой машины с многоканальным комплексом бортового вооружения.

Просчитывалось несколько вариантов, один из которых включал 100-мм пушку — пусковую установку 2А70 в спарке с 30-мм пушкой 2А72 (штатный комплект вооружения БМП-3, включавший комплекс управляемых ракет, аналогичный ПТРК «Кастет»). Другие варианты предусматривали одну или две 30-мм автоматические пушки (2А72 или 2А42) и комплект управляемых ракет «Корнет» или «Атака». Также машины дополнительно оснащались 7,62-мм пулеметами и автоматическими гранатометами калибра 30 или 40 мм.

Защита машины предусматривалась на уровне танка соответствующего поколения. При этом к 1991 году сложилось представление о том, что прямо на базе этого вида техники может быть создана и тяжелая БМП с защищенным отделением для шести десантников. На данный момент определенные следы этого решения видны в техническом облике БМП Т-15 на платформе «Армата».

Боевая машина поддержки танков (БМПТ) «Терминатор-2»

Фото: РИА Новости/Максим Блинов

Явление «Терминатора»

Слово «Терминатор» — маркетинговое обозначение. В России уже летает один такой «Терминатор», он же вертолет Ми-8АМТШ. Как эта система называется на самом деле, не очень понятно.

Известно, что собственно первый «Терминатор» — он же «объект 199» на шасси Т-90 — создавался с 1998 года в рамках ОКР «Рамка-99». Да и в разговорах эту машину называли либо «Рамка», либо просто БМПТ. Примерно к этому же времени из технического облика машины исчезли десантники и она окончательно переродилась из тяжелой универсальной БМП советского времени в специализированное ударное средство.

Это было уже второе явление данного вида техники, подстегнутое в том числе не вполне удачным выступлением отечественной бронетехники в городских боях первой чеченской кампании. 199-й объект восходил к проработкам, о которых речь шла выше, и после некоторых проектных изменений в начале 2000-х выглядел так: две 30-мм пушки 2А42, 7,62-мм пулемет ПКТМ и два 30-мм автоматических гранатомета АГС-17Д. Также машина оборудовалась пусковыми установками для управляемых ракет комплекса «Атака-Т» в тандемном кумулятивном или фугасном исполнении.

Позднее появился собственно «Терминатор-2», также известный как БМПТ-72. Впервые его показали в Нижнем Тагиле в 2013 году. Это всё то же самое, но на шасси Т-72. Тогда же разработчики («Уралвагонзавод») заявили, что аналогичные машины могут быть выполнены как проект модернизации на базе и более старой техники (например, танков Т-55). Позднее была заявлена возможность появления и третьего «Терминатора», уже на шасси «Арматы».

Продажи пока не блещут

Сейчас изделие аккуратно переименовали из БМПТ в БМОП (боевую машину огневой поддержки), что куда больше отражает ее возможности и позволяет позиционировать не только как средство сопровождения танков, но и как самостоятельную технику для действий в городе или контртеррористических операций.

БМПТ «Терминатор-2»

Фото: ТАСС/Антон Новодережкин

Несмотря на впечатляющий комплекс вооружения и красочные демонстрации, БМПТ длительное время имела крайне ограниченный успех на рынке. В 2010 году Минобороны России откровенно забросило этот проект по причине сомнительности боевой эффективности. В 2011–2013 годах несколько машин получил Казахстан.

В 2013 году БМПТ проходила полевые испытания в Алжире, однако достоверные сведения о коммерческих перспективах на этом направлении отсутствуют. Есть непроверенные сведения алжирских источников о контракте на 300 машин, максимально унифицированных с используемыми там же танками Т-90СА. Поставки якобы должны начаться в 2018 году. Подтверждений этой информации пока не было.

В июле 2017 года БМПТ заметили в Сирии, где она проходила обкатку в боевых условиях.

В августе 2017 года российское Министерство обороны заключило контракт с «Уралвагонзаводом» на поставку бронетехники, в том числе и БМПТ (без уточнения конкретного типа). По оценкам экспертов Центра анализа стратегий и технологий, контракт может включать поставку 10 БМПТ и батальонного комплекта (31 единица) модернизированных танков Т-90М.

ЧИТАЙТЕ ТАКЖЕ

 

Dark Fate »(2019) Раскраски

Звезды Линды Гамильтон в« Терминаторе: Темная судьба »(все изображения предоставлены Paramount Pictures).

Франшиза« Терминатор »- одна из самых популярных научно-фантастический сериал на все времена.

В сериале были свои взлеты и падения, но оригинальная сюжетная линия остается культовой. «Скайнет», крупная корпорация в фильме, которая приводит к гибели человечества, стала виртуальным синонимом компаний, производящих машины, которые в конечном итоге может оказаться гораздо более вредным, чем полезным для людей.

Арнольд Шварценеггер в роли Терминатора (все изображения любезно предоставлены Paramount Pictures).

Детям нравятся фильмы о Терминаторе. Самый последний фильм о Терминаторе на момент написания этой статьи — «Терминатор: Темная судьба» (2019). Здесь у нас есть раскраски Терминатор бесплатно и загружаемые из фильмов о Терминаторе.
Сериал «Терминатор» начался с фильма «Терминатор» 1984 года режиссера Джеймса Кэмерона.
«Терминатор: Темная судьба» — шестой фильм серии.У него было рабочее название «Терминатор 6: Тёмная судьба», но позже оно было сокращено.
Хотя «Терминатор» начал серию «Терминатор», большинство фанатов согласятся, что «Терминатор 2: Судный день» (1991) был кульминацией серии на сегодняшний день.
Арнольд Шварценеггер появлялся во всех фильмах о Терминаторе. Он играет футуристического робота, который иногда защищает людей, а иногда и выслеживает их.

Основной сюжет сериала состоит в том, что изобретенные людьми роботы и дроны восстают и захватывают мир.Это заставляет людей скрываться, где они формируют группы сопротивления.
Этот сюжет практически идентичен пьесе чешского писателя Карела Чапека «R.U.R.» 1923 года. «RUR», что является аббревиатурой от универсальных роботов Россум, вводит слово «робот», которое образовано от чешского слова «робот», которое означает принудительный труд.
В «Терминаторе 2» Терминатора играет Арнольд Шварценеггер возвращается в прошлое, чтобы помочь некоторым людям, которым суждено сформировать будущую группу сопротивления.
«Терминатор 2» представил Сару Коннор, которую сыграла Линда Гамильтон.
Сара Коннор — мать будущего основателя сопротивления Джона Коннора. Гамильтон возвращается в «Терминаторе: Темная судьба», чтобы воспроизвести ее персонаж Сары Коннор.
Оригинальный фильм «Терминатор» превратил Арнольда Шварценеггера в главную кинозвезду. Позже он дважды был избран губернатором Калифорнии.
Шварценеггер остается главной кинозвездой, а также возвращается, чтобы сыграть главную роль в «Терминаторе: Темная судьба».
Роберт Патрик сыграл Т-1000, более продвинутого Терминатора из будущего, который путешествует во времени, чтобы уничтожить Сару Коннор и Джона Коннора, прежде чем они смогут сформировать сопротивление в будущем. Многие фанаты скажут вам, что Т-1000 был лучшим злодеем во всей серии.
Роберт Патрик не возвращается в «Терминаторе: Темная судьба», но Эдвард Ферлонг, сыгравший Джона Коннора в «Терминаторе 2», действительно возвращается в качестве того же персонажа.
Джеймс Кэмерон, снявший первые два фильма о Терминаторе, возвращается в качестве продюсера фильма «Терминатор: Темная судьба».
Кэмерон был женат на Линде Гамильтон через несколько лет после «Терминатора 2: Судный день». Позже они развелись.
Линда Гамильтон снялась во многих фильмах и телесериалах после «Терминатора 2».«
Гамильтон прославилась в телесериале 1980-х годов« Красавица и чудовище ».
Маккензи Дэвис также играет главную роль в« Терминаторе 2: Темная судьба ».
Дэвис — канадская актриса, которая, пожалуй, наиболее известна благодаря телесериалу« Остановись и поймай » Огонь », который длился несколько сезонов.
Дата выхода« Терминатора: Тёмные судьбы »- 1 ноября 2019 года.
Ниже представлены трейлеры« Терминатора: Тёмные судьбы ».

2019

Раскраски Арнольда Шварценеггера

Раскраска Арнольд Шварценеггер. Бесплатная версия для печати

Раскраска Арнольд Шварценеггер. Бесплатная печать. Раскраска Арнольд Шварценеггер, раскраска Арнольд Шварценеггер, раскраска Арнольд Шварценеггер Книжка-раскраска Арнольда Шварценеггера Cal Мэр Ифорниана и секс-символ бодибилдинга Великий терминатор и легендарная икона, вдохновленная раскраской для взрослых

Раскраски Терминатор Раскраски бесплатно и загружаемые

Знаменитая звезда Голливуда Раскраска Де Ниро Иствуд Редфорд

Арнольд Шварценеггер из фильма «Терминатор 2» Раскраска

Раскраска Брэд Питт Бесплатные раскраски для печати

Новые раскраски Страница Зевса Геркулес Wecoloringpagecom

Раскраска Бенедикт Арнольд Бесплатные раскраски для печати

Раскраска Анджелина Джоли Бесплатные раскраски для печати

Раскраски Терминатор в Getdrawings Com Бесплатно для

Знаменитая звезда Голливуда Раскраска Де Раскраска Ниро Иствуд Редфорд

Знаменитый актер Раскраски

Новые раскраски Le Рисунок Геркулеса. Раскраски с Терминатором. Скачать бесплатно

. Терминатор. Раскраски на Getdrawings Com. Бесплатно. Для

.

. Скачать бесплатно. Раскраски с изображением героев.

.

. Терминатор. Арнольд Шварценеггер. Терминатор. Автор: Мерфи Эллиот. Арнольд. Раскраски

Лучшие изображения раскраски Арнольд бесплатно Скачать из 8

Раскраска Райан Рейнольдс Рыцарь-джедай Квай Гон Джинн

Раскраски Терминатор Раскраски бесплатно и для скачивания

Арт-терапия Арнольда Шварценеггера Книжка-раскраска Арнольд

Записная книжка Арнольда Шварценеггера Раскраска Your Goals Perfect

Известный актер

Эй, Арнольд Арнольд и дедушка Фил К. izi Free Coloring

The Terminator Coloring Book By Mark Jones

Amelia Earhart Coloring Page Бесплатные раскраски для печати

Цифровые раскраски Чужой и Хищник Сигурни Уивер в роли Рипли Арнольд Шварценеггер в образе голландца Instant Print Coloring Pages

12 Times Arnold S Website Morphed С 96 Unshrouder

Раскраска Ковбой с двумя ружьями Бесплатная раскраска для печати

Раскраски с известным актером

Раскраски знаменитостей Арнольд Шварценеггер для печати

Брюс Ли Раскраска Бесплатные раскраски для печати

Новые раскраски Пегас с головным убором идеи изображения

Бесплатные раскраски для детей Psy Celebrity Friv

Раскраски с известными актерами

Fam ous Star Hollywood Раскраска Де Ниро Иствуд Редфорд

Эй, Арнольд Арнольд и Джеральд Смеются, Кизи бесплатно

Новые раскраски Геркулес Иисус Христос Getcoloringpages

Раскраска Арнольд Шварценеггер из фильма Терминатор 2 Раскраска

Lovebug Snapdragon от Lovebugandsnapdragon

Страница на Getdrawings Com бесплатно для

Color Me Arnold Неофициальный Арнольд Шварценеггер

Arnold Schwarzenegger Arnold Hd рисунок рабочего стола

Раскраски известного актера

Schwarzenegger Png и векторы Скачать бесплатные раскраски Арнольд из 8

Новые раскраски Страница Зевса Геркулес Wecoloringpagecom

Герои боевиков Цифровая книжка-раскраска Мгновенная печать Pdf Путешествие Дождливый день Арт-терапия Раскраска Арнольд Шварценеггер

Раскраска Арнольда Шварценеггера и бесплатное руководство

Раскраска Арнольд Шварценеггер из фильма Терминатор 2 Собаки

Раскраски Pages Free And Printable

Audrey Hepburn Celebrity Kizi Free Coloring Pages For

Раскраски с известными актерами

Раскраски со знаменитостями Иванки Трамп для печати

Раскраски с известной звездой Голливуда Де Ниро Иствуд Редфорд

Раскраски с Ким Кардашьян Бесплатные раскраски для печати

Раскраска полицейская собака на Getdrawings Com Free для

Арнольд Шварценеггер Historyof Бодибилдинг Ком Арнольд

Ariana Grande Songs Раскраска Ариана Гранде

Lovebug Snapdragon By Lovebugandsnapdragon On Etsy

Новые раскраски Бэби Дори Геркулес Лучший бесплатный бродяга

Раскраски Гринч Раскраски бесплатно и загружаемые

Гарри Стайлз Раскраски знаменитостей

Арнольд Шварценеггер Раскраска для взрослых Терминатор и

Эй, Арнольд Война Кизи Бесплатные раскраски для детей

Бэтмен Раскраски Солнце Цветочные страницы

Роберт Дауни-младший Раскраска Бесплатные раскраски для печати

Раскраска Терминатор от Марка Джонса

Новые раскраски Жук-Геркулес Страница для печати

Большой удобный диван Большой удобный диван Супер раскраска

Чужой и хищник Цифровые раскраски Сигурни Уивер в образе Рипли Арнольд Шварценеггер в образе голландца Мгновенная печать раскраски

Раскраски PNG Прозрачные раскраски Png Image

Раскраски Терминатор Раскраски бесплатно и для скачивания

Знаменитая звезда Голливуда Раскраска Де Ниро Иствуд Редфорд

Раскраски Меч в Getdrawings Com Free For Personal

Новые раскраски Страница Зевса Геркулес Wecoloringpagecom

Лучшие раскраски

Детские раскраски для детей

Арнольд Бесплатные распечатать раскраски для девочек и мальчиков

Арнольд Шварценеггер Раскраски знаменитостей для печати

Конан-варвар Арнольд Шварценеггер By Leftofreality

Free Arnold Schwarzenegger Png Transparent Images Pikpng

Австрия Раскраска Crayola Com

Ранвир Сингх Раскраски Живопись для малышей и рисование для детей

Бруклин Девять Девять Цифровая Книжка-раскраска Мгновенная печать Pdf Путешествие или Дождливый день Деятельность Секретный подарок Санта-Клауса Арт-терапия Раскраска Страницы

Том Хэнкс в роли Форреста Гампа. Раскраска для бесплатной печати

Новые раскраски Детские Пегас картинки Imagixs Геркулес

Бейонсе знаменитости Friv Бесплатные раскраски для детей

GitHub — lchrzaszcz / colorize: Colorize — плагин терминатора для раскраски заголовка каждого терминал отдельно

GitHub — lchrzaszcz / colorize: Colorize — плагин терминатора для раскрашивания заголовка каждого терминала отдельно

Colorize — плагин терминатора для раскрашивания заголовка каждого терминала отдельно

Файлы

Постоянная ссылка Не удалось загрузить последнюю информацию о фиксации.

Тип

Имя

Последнее сообщение фиксации

Время фиксации

Colorize — плагин терминатора для раскрашивания строки заголовка и фона каждого терминала отдельно

1. Скопируйте colorize. py в каталог плагина при установке терминатора (например: / usr / share / terminator / terminatorlib / plugins или ~ /.config / терминатор / плагины / )
2. Включить надстройку в настройках надстройки (щелкните правой кнопкой мыши терминатор> Настройки> Подключаемые модули> щелкните раскрасить)

1. Терминатор запуска (очевидно: P)
2. Щелкните правой кнопкой мыши терминал и
   • выберите «Выбрать цвет», чтобы установить собственный цвет, или
   • выберите предустановленный цвет из подменю «Выбрать цвет» или
   • выберите «Раскрасить фон», чтобы установить фон терминала в соответствии с цветом строки заголовка.
   • выберите «Восстановить фон», чтобы восстановить значение фона по умолчанию.

Горячие клавиши для «Выбрать цвет» пока не работают

1. Сделайте ярлыки для работы «Выбор цвета»: P
2. Какой-то GUI
3. Инструкция по настройке плагина в текстовом режиме
4. Наследовать цвета после разделения

Около

Colorize — плагин терминатора для раскрашивания заголовка каждого терминала отдельно

ресурсов

Лицензия

Вы не можете выполнить это действие в настоящее время. Вы вошли в систему с другой вкладкой или окном. Перезагрузите, чтобы обновить сеанс. Вы вышли из системы на другой вкладке или в другом окне. Перезагрузите, чтобы обновить сеанс.

Четырехцветное секвенирование ДНК путем синтеза с использованием обратимых терминаторов расщепляемых флуоресцентных нуклеотидов

Абстрактные

Секвенирование ДНК путем синтеза (SBS) на твердой поверхности во время полимеразной реакции предлагает парадигму для расшифровки последовательностей ДНК. Мы сообщаем здесь о создании такой системы секвенирования ДНК с использованием подходов молекулярной инженерии.В этом подходе четыре нуклеотида (A, C, G, T) модифицируются как обратимые терминаторы, присоединяя расщепляемый флуорофор к основанию и блокируя группу 3′-OH небольшой химически обратимой составляющей, так что они все еще распознаются ДНК. полимераза в качестве субстратов. Мы обнаружили, что аллильный фрагмент может быть успешно использован в качестве линкера для связывания флуорофора с 3′- O -аллил-модифицированными нуклеотидами, образуя химически расщепляемые флуоресцентные нуклеотидные обратимые терминаторы, 3′- O -аллил-dNTPs-allyl -флуорофор, для применения в SBS. Флуорофор и 3′- O -аллильная группа в продукте удлинения ДНК, который образуется путем включения 3′- O -аллил-dNTPs-аллил-флуорофора в полимеразную реакцию, удаляются одновременно за 30 секунд путем Деаллилирование, катализируемое палладием, в водном буферном растворе. Таким образом, эта одностадийная реакция двойного деаллилирования позволяет повторно инициировать полимеразную реакцию и увеличивает эффективность SBS. Матрицы ДНК, состоящие из гомополимерных областей, были точно секвенированы с использованием этого класса флуоресцентных аналогов нуклеотидов на ДНК-чипе и четырехцветном флуоресцентном сканере.

Секвенирование ДНК является движущей силой исследований и открытий в области геномики. Завершение проекта «Геном человека» заложило основу для скрининга генетических мутаций с целью выявления генов болезней в масштабе всего генома (1). Для исследования полной последовательности генома человека для применения в клинической медицине и здравоохранении необходимы точные высокопроизводительные методы секвенирования ДНК. Чтобы преодолеть ограничения современной технологии секвенирования на основе электрофореза (2–5), было исследовано множество новых методов секвенирования ДНК.Такие подходы включают секвенирование путем гибридизации (6), секвенирование на основе масс-спектрометрии (7–9), определение последовательности одноцепочечной ДНК с использованием инженерных нанопор (10) и секвенирование путем лигирования (11). В последнее время широко изучались подходы к секвенированию ДНК путем синтеза (SBS), такие как пиросеквенирование (12), секвенирование отдельных молекул ДНК (13) и полимеразных колоний (14).

Концепция ДНК-SBS была раскрыта в 1988 году при попытке секвенирования ДНК путем обнаружения пирофосфатной группы, которая образуется при включении нуклеотида в ДНК-полимеразную реакцию (15).Пиросеквенирование, которое было разработано на основе этой концепции и ферментативного каскада, было исследовано для секвенирования генома (16). Однако этому методу присущи трудности с определением числа включенных нуклеотидов в гомополимерных областях матрицы. Кроме того, каждый из четырех нуклеотидов необходимо добавлять и обнаруживать отдельно, что увеличивает общее время обнаружения. Накопление неразрушенных нуклеотидов и других компонентов также может снизить точность метода при секвенировании длинной матрицы ДНК.Таким образом, желательно иметь простой метод прямого обнаружения репортерной группы, присоединенной к нуклеотиду, который включается в растущую цепь ДНК в полимеразной реакции, а не полагаться на сложный ферментативный каскад. Схема SBS, основанная на обнаружении флуоресценции в сочетании с форматом чипа, может значительно увеличить производительность проектов секвенирования ДНК. Следовательно, несколько групп исследовали такую ​​систему с целью создания сверхвысокопроизводительного метода секвенирования ДНК (17, 18).До сих пор не опубликовано ни одного полного успеха использования такой системы для однозначной секвенирования ДНК.

Предыдущая работа в литературе, посвященная исследованию метода SBS, в основном сосредоточена на разработке и синтезе расщепляемого химического фрагмента, который связан с флуоресцентным красителем, чтобы блокировать 3′-OH группу нуклеотидов (19–21). Обоснование состоит в том, что после удаления флуорофора 3′-ОН будет регенерироваться, чтобы позволить последующее добавление нуклеотидов. Однако не сообщалось об успехе включения такого нуклеотида с расщепляемым флуоресцентным красителем в 3′-положении под действием ДНК-полимеразы в растущую цепь ДНК.Причина в том, что положение 3 ‘на дезоксирибозе очень близко к аминокислотным остаткам в активном центре полимеразы, и поэтому полимераза чувствительна к модификации в этой области рибозного кольца, особенно с большим флуорофором (22 ).

Известно, что некоторые модифицированные ДНК-полимеразы хорошо переносятся нуклеотидами с обширными модификациями с объемными группами, такими как красители для переноса энергии в 5-м положении пиримидинов (Т и С) и 7-положении пуринов (G и A) (23, 24).Определены тройные комплексы ДНК-полимеразы крысы, ДНК-матрица-праймер и дидезоксицитидинтрифосфат (22), что подтверждает этот факт. Таким образом, мы рассудили, что если уникальный флуоресцентный краситель связан с 5-положением пиримидинов (T и C) и 7-положением пуринов (G и A) через расщепляемый линкер, и небольшой химический фрагмент используется для кэпирования группы 3′-OH, полученные аналоги нуклеотидов должны быть способны встраиваться в растущую цепь ДНК в качестве терминаторов. Основываясь на этом обосновании, мы предложили подход SBS с использованием расщепляемых флуоресцентных аналогов нуклеотидов в качестве обратимых терминаторов для секвенирования иммобилизованной на поверхности ДНК [вспомогательная информация (SI), рис.6] (25). В этом подходе нуклеотиды модифицируются в двух конкретных местах, так что они все еще распознаются ДНК-полимеразой как субстраты: ( i ) другой флуорофор с отчетливой флуоресцентной эмиссией связан с каждым из четырех оснований через расщепляемый линкер и ( ii ) 3′-ОН группа блокирована небольшим химически обратимым фрагментом. ДНК-полимераза включает только однонуклеотидный аналог, комплементарный основанию на матрице ДНК, ковалентно связанной с поверхностью.После включения детектируется уникальное флуоресцентное излучение для идентификации встроенного нуклеотида, а затем флуорофор удаляется. Затем 3′-OH группа химически регенерируется, что позволяет продолжить следующий цикл полимеразной реакции. Поскольку большая поверхность чипа ДНК может иметь высокую плотность пятен различных шаблонов ДНК, каждый цикл может идентифицировать множество оснований параллельно, что позволяет одновременно секвенировать большое количество молекул ДНК. Ранее мы установили возможность выполнения SBS на чипе с использованием четырех фоторасщепляемых флуоресцентных аналогов нуклеотидов (26) и обнаружили, что аллильная группа может использоваться в качестве расщепляемого линкера для связывания флуорофора с нуклеотидом (27).Мы также сообщили о создании и синтезе двух фоторасщепляемых флуоресцентных нуклеотидов в качестве обратимых терминаторов для полимеразной реакции (28, 29).

Наши предыдущие исследовательские усилия твердо установили стратегию молекулярного уровня для рациональной модификации нуклеотидов путем присоединения расщепляемого флуоресцентного красителя к основанию и блокирования 3′-OH небольшой химически обратимой составляющей для SBS. Этот подход был недавно принят Genomics Industry, чтобы потенциально предоставить платформу для секвенирования ДНК (30).Здесь мы сообщаем о разработке и синтезе четырех химически расщепляемых аналогов флуоресцентных нуклеотидов в качестве обратимых терминаторов для SBS. Каждый из аналогов нуклеотидов содержит 3′- O -аллильную группу и уникальный флуорофор с отчетливой флуоресцентной эмиссией у основания через расщепляемый аллильный линкер. Мы впервые установили, что эти аналоги нуклеотидов являются хорошими субстратами для ДНК-полимеразы в реакции удлинения ДНК в фазе раствора и что флуорофор и 3′- O -аллильная группа могут быть удалены с высокой эффективностью в водном растворе.Затем мы выполнили SBS с использованием этих четырех химически расщепляемых аналогов флуоресцентных нуклеотидов в качестве обратимых терминаторов для идентификации ≈20 непрерывных оснований матрицы ДНК, иммобилизованной на чипе. Точные последовательности ДНК были получены для матриц ДНК, содержащих гомополимерные последовательности. Матрица ДНК была иммобилизована на поверхности чипа, который содержит линкер PEG с химией 1,3-диполярного азид-алкинового циклоприсоединения. Эти результаты показали, что успешные расщепляемые флуоресцентные обратимые терминаторы нуклеотидов для четырехцветного секвенирования ДНК путем синтеза могут быть созданы путем присоединения расщепляемого флуорофора к основанию и кэпирования 3′-OH небольшой химически обратимой составляющей, чтобы они все еще распознавались ДНК полимераза в качестве субстратов. Дальнейшая оптимизация подхода приведет к еще большей длине чтения при секвенировании.

Результаты и обсуждение

Дизайн и синтез химически расщепляемых флуоресцентных аналогов нуклеотидов в качестве обратимых терминаторов для SBS.

Чтобы продемонстрировать возможность проведения секвенирования ДНК de novo путем синтеза на чипе, четыре химически расщепляемых флуоресцентных аналога нуклеотидов (3′- O -аллил-dCTP-allyl-bodipy-FL-510, 3′- O -аллил-dUTP-аллил-R6G, 3′- O -аллил-dATP-аллил-ROX и 3′- O -allyl-dGTP-allyl-bodipy-650 / Cy5) (R6G, 6- карбоксиродамин-6G; Rox, 6-карбокси-X-родамин; бодипи, 4,4-дифтор-4-бора-3α, 4α-диаза-s-индацен; рис.1) были разработаны и синтезированы как обратимые терминаторы для ДНК-полимеразной реакции. Было показано, что модифицированные ДНК-полимеразы обладают высокой толерантностью к нуклеотидным модификациям с объемными группами в 5-м положении пиримидинов (C и U) и 7-м положении пуринов (A и G). Таким образом, мы прикрепили каждый уникальный флуорофор к положению 5 C / U и положению 7 A / G через аллилкарбаматный линкер. Однако из-за непосредственной близости 3′-положения сахарного кольца нуклеотида к аминокислотным остаткам активного сайта ДНК-полимеразы относительно небольшой аллильный фрагмент был выбран в качестве 3′-ОН обратимой кэпирующей группы.Мы обнаружили, что флуорофор и 3′- O -аллильная группа в продукте удлинения ДНК, который образуется в результате включения химически расщепляемых флуоресцентных аналогов нуклеотидов, удаляются одновременно за 30 секунд путем катализируемого Pd деаллилирования в водном растворе. . Таким образом, эта одностадийная реакция двойного деаллилирования позволяет повторно инициировать полимеразную реакцию. Подробная процедура синтеза и характеристика четырех аналогов нуклеотидов на рис. 1 описаны в SI Text . .

Рисунок 1.

Структуры 3′- O -аллил-dCTP-аллил-боди-FL-510 [λ _{абс (макс.)} = 502 нм; λ _{em (макс.)} = 510 нм], 3′- O -аллил-dUTP-аллил-R6G [λ _{абс (макс.)} = 525 нм; λ _{em (макс.)} = 550 нм], 3′- O -аллил-дАТФ-аллил-ROX [λ _{абс (макс.)} = 585 нм; λ _{em (макс.)} = 602 нм] и 3′- O -аллил-dGTP-аллил-бодипи-650 [λ _{абс (макс.)} = 630 нм; λ _{em (макс.)} = 650 нм].

Чтобы убедиться, что эти флуоресцентные аналоги нуклеотидов точно включены основно-специфическим образом в полимеразную реакцию, в растворе были проведены четыре непрерывных стадии удлинения ДНК и деаллилирования. Это позволяет выделить продукт ДНК на каждом этапе для детальной характеристики молекулярной структуры с помощью масс-спектрометрии (МС) MALDI-TOF, как показано на рис. 2. Первый продукт удлинения 5′-U (аллил-R6G) -3′- O -аллил ( 1 ) очищали с помощью ВЭЖХ и анализировали с помощью MALDI-TOF MS (рис. 2 А ). Затем этот продукт делалилировали с использованием смеси деаллилирования, катализируемой Pd [1 × реакционный буфер Thermopol I / Na ₂ PdCl ₄ / P (PhSO ₃ Na) ₃ ]. Активный катализатор Pd генерируется из Na ₂ PdCl ₄ и лиганда P (PhSO ₃ Na) ₃ (TPPTS), чтобы опосредовать реакцию деаллилирования в ДНК-совместимых водных условиях для одновременного расщепления флуорофора и 3′- O -аллильная группа (28).Деаллилированный продукт ( 2 ) также был проанализирован с использованием MALDI-TOF MS (фиг. 2 В ). Как видно на рис. A , спектр MALDI-TOF MS состоит из отчетливого пика на м / z 6469, соответствующего продукту удлинения ДНК 5′-U (аллил-R6G) -3′- O -аллил ( 1 ), что подтверждает, что аналог нуклеотида может быть включен в основание специфически среди пула всех четырех (A, C, G, T) ДНК-полимеразой в растущую цепь ДНК. Рис. 2 B показывает результат деаллилирования указанного выше продукта ДНК. Пик на м / z 6469 полностью исчез, тогда как пик, соответствующий двойному деаллилированному продукту 5’– U ( 2 ), появляется как единственный доминирующий пик на м / z 5870, который устанавливает, что катализируемая Pd реакция деаллилирования полностью расщепляет как флуорофор, так и 3′- O -аллильную группу с высокой эффективностью без повреждения ДНК.Следующую реакцию удлинения проводили с использованием этого деаллилированного продукта ДНК со свободной 3′-ОН группой, регенерированной в качестве праймера, вместе с смесью четырех модифицированных аллилом флуоресцентных нуклеотидов с получением продукта удлинения 5′-UG (аллил-боди-650) 3′- O -аллил ( 3 ). Как описано выше, продукт удлинения 3 был проанализирован с помощью MALDI-TOF MS, дав доминирующий пик на м / z 6984 (рис. 2 C ), а затем деаллилировали для дальнейшего МС-анализа с получением единственного пика при мкм / z 6256 (продукт 4 ) (рис.2 D ). Третья реакция удлинения дает 5′-UGA (аллил-ROX) -3′- O -аллил ( 5 ), четвертая реакция удлинения дает 5′-UGAC (аллил-боди-FL-510) -3 ‘ — O -аллил ( 7 ), и их реакции деаллилирования с получением продуктов 6 и 8 были аналогичным образом проведены и проанализированы с помощью MALDI-TOF MS, как показано на рис. E — H . Химические структуры продуктов удлинения и расщепления для каждой стадии показаны на SI Рис.7. Эти результаты демонстрируют, что синтезированные выше четыре химически расщепляемых флуоресцентных аналога нуклеотидов успешно включаются с высокой точностью в растущую цепь ДНК в ходе полимеразной реакции, и, кроме того, как флуорофор, так и 3′- O -аллильная группа являются эффективно удаляются с помощью реакции деаллилирования, катализируемой Pd, что делает возможным их использование для SBS на чипе.

Инжир.2.

Схема полимеразного удлинения ( слева, ) и MALDI-TOF MS-спектры четырех последовательных продуктов удлинения и их деаллилированных продуктов ( справа ). Праймер, удлиненный 3′- O -аллил-dUTP-аллил-R6G (1) и его деаллилированный продукт 2; Продукт 2 дополнен 3′- O -аллил-dGTP-аллил-боди-650 (3) и его деаллилированным продуктом 4; Продукт 4 дополнен 3′- O -аллил-дАТФ-аллил-ROX (5) и его деаллилированным продуктом 6; Продукт 6 дополнен 3′- O -аллил-dCTP-allyl-bodipy-FL-510 (7) и его деаллилированным продуктом (8).После 30 с инкубации со смесью палладий / TPPTS при 70 ° C деаллилирование завершается, и как флуорофоры, так и 3′- O -аллильные группы отщепляются от продуктов удлиненной ДНК.

Четырехцветное секвенирование ДНК с химически расщепляемыми флуоресцентными аналогами нуклеотидов в качестве обратимых терминаторов на ДНК-чипе.

Затем химически расщепляемые флуоресцентные аналоги нуклеотидов использовали в реакции SBS для идентификации последовательности матрицы ДНК, иммобилизованной на твердой поверхности.Химию связывания сайт-специфичного 1,3-диполярного циклоприсоединения использовали для ковалентной иммобилизации меченой алкином самозаполняющейся ДНК-матрицы на азидофункционализированной поверхности в присутствии катализатора Cu (I). Основное преимущество, предлагаемое использованием самопраймеров по сравнению с использованием отдельных праймеров и матриц, состоит в том, что ковалентное связывание праймера с матрицей в самопраймерном фрагменте предотвращает любую возможную диссоциацию праймера от матрицы во время процесс SBS.Чтобы предотвратить неспецифическое поглощение невключенных флуоресцентных нуклеотидов на поверхности чипа, линкер PEG вводится между матрицами ДНК и поверхностью чипа (SI рис. 8). Было показано, что этот подход дает очень низкую фоновую флуоресценцию после расщепления для удаления флуорофора, что демонстрируется данными секвенирования ДНК, описанными ниже.

Сначала мы выполнили SBS на матрице ДНК, иммобилизованной на чипе, которая не имеет гомополимерных последовательностей, с использованием четырех химически расщепляемых флуоресцентных обратимых терминаторов нуклеотидов (3′- O -аллил-dCTP-allyl-bodipy-FL-510, 3′- O -аллил-дУТФ-аллил-R6G, 3′- O -аллил-dATP-аллил-ROX и 3′- O -аллил-dGTP-аллил-Cy5), и результаты показаны на рис.3. Структура самозирующейся части ДНК схематически показана на рис. 3. A , с первыми 13 нуклеотидными последовательностями сразу после сайта праймирования. Реакция секвенирования de novo на чипе была инициирована путем удлинения самопраймирующейся ДНК с использованием раствора, содержащего все четыре 3′- O -аллил-dNTPs-аллил-флуорофор и мутантную ДНК-полимеразу 9 ° N. Чтобы свести на нет любой запаздывающий сигнал флуоресценции, который вызван ранее не растянутой прайм-цепью, был добавлен этап синхронизации, чтобы уменьшить количество невытянутых прайм-цепей после удлинения флуоресцентными нуклеотидами. Смесь реакции синхронизации, состоящая из всех четырех 3′- O -аллил-dNTP (рис. 4), которые имеют более высокую эффективность включения полимеразы из-за отсутствия флуорофора по сравнению с более объемным 3′- O -аллил -dNTPs-аллил-флуорофор использовали вместе с мутантной ДНК-полимеразой 9 ° N для удлинения любой оставшейся праймирующей цепи, которая имеет свободную 3′-OH группу, чтобы синхронизировать включение. Удлинение 3′- O -аллил-dNTP также усиливает ферментативное включение следующего аналога нуклеотида, поскольку после расщепления для удаления 3′- O -аллильной группы продукт ДНК удлиняется на 3′- O -аллил-dNTP не содержат модификационных групп.После отмывки удлинение праймера только комплементарным флуоресцентным нуклеотидом было подтверждено наблюдением красного сигнала (излучение Cy5) в четырехцветном флуоресцентном сканере (рис. 3). В1 ). После обнаружения флуоресцентного сигнала поверхность чипа погружали в деаллилирующую смесь [1 × реакционный буфер Thermolpol I / Na ₂ PdCl ₄ / P (PhSO ₃ Na) ₃ ] и инкубировали в течение 5 мин. при 60 ° C для одновременного расщепления флуорофора и 3′- O -аллильной группы.Затем чип немедленно погружали в 3 М трис · HCl-буфер (pH 8,5) и инкубировали в течение 5 минут при 60 ° C для удаления комплекса Pd. Затем поверхность была промыта, и был обнаружен незначительный остаточный флуоресцентный сигнал, подтверждающий расщепление флуорофора. За этим последовала другая реакция удлинения с использованием смеси 3′- O -аллил-dNTPs-аллил-флуорофор для включения следующего флуоресцентного нуклеотида, комплементарного последующему основанию на матрице. Весь процесс включения, синхронизации, обнаружения и расщепления был выполнен несколько раз с использованием четырех химически расщепляемых обратимых терминаторов флуоресцентных нуклеотидов для идентификации 13 последовательных оснований в матрице ДНК.Изображение флуоресценции чипа для каждого добавления нуклеотида показано на рис. B , а график зависимости интенсивности флуоресценции от хода расширения секвенирования (необработанные данные четырехцветного секвенирования) показан на рис. С . Последовательности ДНК однозначно идентифицируются по необработанным данным четырехцветной флуоресценции без какой-либо обработки.

Инжир.3.

Четырехцветное секвенирование по данным синтеза на ДНК-чипе. ( A ) Схема реакции SBS на чипе с использованием четырех химически расщепляемых флуоресцентных нуклеотидов. ( B ) Отсканированные четырехцветные флуоресцентные изображения для каждого этапа SBS на чипе: (1) включение 3′- O -аллил-dGTP-аллил-Cy5; (2) отщепление аллил-Cy5 и 3′-аллильной группы; (3) включение 3′- O -аллил-дАТФ-аллил-ROX; (4) отщепление аллил-ROX и 3′-аллильной группы; (5) включение 3′- O -аллил-dUTP-аллил-R6G; (6) отщепление аллил-R6G и 3′-аллильной группы; (7) включение 3′- O -аллил-dCTP-аллил-боди-FL-510; (8) расщепление аллил-бодипи-FL-510 и 3′-аллильной группы; изображения 9–25 создаются аналогичным образом.( C ) График (данные четырехцветного секвенирования) исходной интенсивности излучения флуоресценции при четырех обозначенных длинах волн излучения четырех химически расщепляемых флуоресцентных нуклеотидов в зависимости от прогресса расширения секвенирования.

Рис. 4.

Структуры 3′- O -аллил-дАТФ, 3′- O -аллил-dCTP, 3′- O -аллил-dGTP и 3′- O -аллил-дТТФ.

Сравнение четырехцветного SBS с пиросеквенированием.

Для дополнительной проверки преимущества метода SBS с использованием четырех химически расщепляемых флуоресцентных обратимых терминаторов нуклеотидов, мы провели аналогичную реакцию секвенирования, как описано выше, на матрице ДНК, которая содержала две отдельные гомополимерные области (отрезок из 10 Т и пяти Т), как показано на Рис. 5 А . Эти исходные данные секвенирования были получены путем добавления всех четырех флуоресцентных обратимых терминаторов нуклеотидов вместе к матрице ДНК, иммобилизованной на чипе, с последующей реакцией синхронизации с четырьмя 3′- O -аллил-dNTP, обнаруживая уникальное излучение флуоресценции для определения последовательности, затем расщепление флуорофора и 3′- O -аллильной группы за один этап для продолжения циклов секвенирования.Все 20 оснований, включая индивидуальную основу (A, T, C, G), 10 повторяющихся A и пять повторяющихся A, четко определены. Небольшие группы пиков между идентифицированными основаниями представляют собой флуоресцентный фон от ДНК-чипа, который не увеличивается по мере продолжения цикла. Рис. 5 B показывает данные пиросеквенирования той же матрицы ДНК, содержащей гомополимерные последовательности. Четко определены первые четыре отдельные базы. Две гомополимерные области (10 A) и (пять A) дают два больших пика, но очень трудно идентифицировать точную последовательность из данных.

Рис. 5.

Сравнение четырехцветного секвенирования по данным синтеза и пиросеквенирования. ( A ) Необработанные данные четырехцветного секвенирования ДНК с нашим секвенированием путем химического синтеза с использованием матрицы, содержащей две гомополимерные области. Индивидуальная основа (A, T, C, G), 10 повторяющихся A и пять повторяющихся A четко определены.Небольшие группы пиков между идентифицированными основаниями представляют собой флуоресцентный фон от ДНК-чипа, который не увеличивается по мере продолжения цикла. ( B ) Данные пиросеквенирования той же матрицы ДНК, содержащей гомополимерные области (10 Т и пять Т). Четко определены первые четыре отдельные базы. Две гомополимерные области (10 A) и (пять A) дают два больших пика, которые очень трудно идентифицировать точную последовательность из данных.

Заключение

Мы синтезировали и охарактеризовали четыре химически расщепляемых флуоресцентных аналога нуклеотидов и использовали их для получения четырехцветных данных секвенирования ДНК de novo на чипе.При этом мы выполнили два важных требования для использования метода SBS для однозначной секвенирования ДНК. Во-первых, была успешно реализована стратегия использования химически обратимого фрагмента для блокирования 3′-ОН-группы нуклеотида, так что нуклеотид завершает полимеразную реакцию, позволяя идентифицировать включенный нуклеотид. Кроме того, эти обратимые терминаторы позволяют добавлять все четыре нуклеотида одновременно при выполнении SBS. Это в конечном итоге сокращает количество циклов, необходимых для завершения цикла секвенирования, повышает точность секвенирования из-за конкуренции четырех нуклеотидов в полимеразной реакции и позволяет точно определять гомополимерные области матрицы ДНК.Во-вторых, эффективное удаление как флуорофора, так и кэпирующей группы 3′-OH после успешного обнаружения сигнала флуоресценции, что увеличивает общую эффективность SBS.

Ключевым фактором, определяющим длину считывания при секвенировании нашего подхода с четырехцветным SBS, является ступенчатый выход, который определяется эффективностью включения нуклеотидов и выходом расщепления флуорофора и кэпирующей группы 3′-OH из ДНК. продукты расширения.Этот ступенчатый выход составляет ≈99% на основании измерения продуктов ДНК в фазе раствора. Урожайность на поверхности трудно точно измерить из-за колебаний флуоресцентного изображения при использовании современного ручного флуоресцентного сканера. Сильный сигнал флуоресценции даже для 20-го основания, показанного на рис. 5, указывает на то, что мы должны иметь возможность еще больше увеличить длину считывания. Что касается длины считывания, секвенирование по Сэнгеру по-прежнему является золотым стандартом с длиной считывания> 800 п.н., но с ограничениями по производительности и стоимости.Длина считывания пиросеквенирования составляет ≈100 п.н., но с высокой частотой ошибок из-за сложности точного определения последовательностей гомополимеров. Длина нашего четырехцветного считывания SBS на ручном флуоресцентном сканере в настоящее время составляет ≈20 п.н. с высокой точностью. Ожидается, что эта длина считывания увеличится, когда все этапы удлинения, расщепления и промывки будут автоматизированы. ДНК-полимеразы и флуоресцентное мечение, используемые в автоматическом методе четырехцветного секвенирования по Сэнгеру, претерпели почти два десятилетия последовательных постепенных улучшений после того, как были установлены основные флуоресцентные методы Сэнгера (2, 3).Следуя тому же пути, ожидается, что основной принцип и стратегия, изложенные в нашем методе четырехцветного SBS, будут стимулировать дальнейшее улучшение секвенирования методом синтеза с разработкой высокоэффективных полимераз, адаптированных для расщепляемых флуоресцентных терминаторов нуклеотидов, и тестирования альтернативных линкеров. и 3′-ОН обратимый кэпирующий фрагмент. Хорошо известно, что с помощью эмульсионной ПЦР на микрошариках миллионы различных ДНК-матриц иммобилизуются на поверхности чипа (11, 16).Эти высокоплотные шаблоны ДНК в сочетании с нашим четырехцветным SBS-подходом создадут высокопроизводительную (> 20 миллионов оснований на чип) и высокоточную платформу для различных проектов секвенирования и цифрового анализа экспрессии генов.

Материалы и методы

Синтез 3′-

O -аллил-dNTPs-аллил-флуорофор.

Подробный синтез химически расщепляемых флуоресцентных нуклеотидов 3′- O -аллил-dCTP-аллил-бодипи-FL-510, 3′- O -аллил-dUTP-аллил-R6G, 3′- O -аллил-дАТФ-аллил-ROX, 3′- O -аллил-dGTP-аллил-боди-650 и 3′- O -аллил-dGTP-аллил-Cy5 описаны в SI Text .

Конструирование чипа с иммобилизованным шаблоном самопрайминга ДНК.

ДНК-чип был сконструирован, как показано на SI Рис. 8, а подробные шаги описаны в SI Text .

Непрерывная ДНК-полимеразная реакция с использованием четырех химически расщепляемых флуоресцентных нуклеотидов в качестве обратимых терминаторов в растворе.

Мы охарактеризовали четыре аналога нуклеотидов 3′- O -аллил-dCTP-аллил-бодипи-FL-510, 3′- O -аллил-dUTP-аллил-R6G, 3′- O -аллил- dATP-allyl-ROX и 3′- O -allyl-dGTP-allyl-bodipy-650, последовательно выполняя четыре непрерывных реакции удлинения ДНК с использованием праймера (5′-AGAGGATCCAACCGAGAC-3 ‘) и синтетической ДНК-матрицы ( 5’-GTGTACATCAACATCACCTACCACCATGTCAGTCTCG-GTTGGATCCTCTATTGTGTCCGG-3 ‘) на основе части экзона 7 гена p53 человека.Подробные экспериментальные процедуры описаны в SI Text . .

Реакция четырехцветного SBS на чипе с четырьмя химически расщепляемыми флуоресцентными нуклеотидами в качестве обратимых терминаторов.

Десять микролитров раствора, состоящего из 3′- O -аллил-dCTP-аллил-бодипи-FL-510 (3 пмоль), 3′- O -аллил-dUTP-аллил-R6G (10 пмоль), 3′- O -аллил-dATP-аллил-ROX (5 пмоль) и 3′- O -аллил-dGTP-аллил-Cy5 (2 пмоль), 1 единица мутантной ДНК-полимеразы 9 ° N, и 1 × реакционный буфер Thermolpol II наносили пятнами на поверхность чипа, где иммобилизовали самопримированный фрагмент ДНК.Нуклеотидному аналогу, комплементарному матрице ДНК, давали возможность включиться в праймер при 68 ° C в течение 10 мин. Чтобы синхронизировать любые неинкорпорированные шаблоны, раствор расширения, состоящий из 30 пмоль каждого из 3′- O -аллил-дЦТФ, 3′- O -аллил-дТТФ, 3′- O -аллил-дАТФ и 3 ‘ — O -аллил-dGTP, 1 единица 9 ° N мутантной ДНК-полимеразы и 1X реакционный буфер Thermolpol II наносили на то же место и инкубировали при 68 ° C в течение 10 мин. После промывки чипа буфером SPSC, содержащим 0.1% Tween 20 в течение 5 минут, поверхность промывали dH ₂ O, недолго сушили и затем сканировали четырехцветным сканером ScanArray Express (PerkinElmer Life Sciences, Бостон, Массачусетс) для обнаружения сигнала флуоресценции. Четырехцветный сканер оснащен четырьмя лазерами с длинами волн возбуждения 488, 543, 594 и 633 нм и фильтрами излучения с центрами 522, 570, 614 и 670 нм. Для деаллилирования чип погружали в смесь деаллилирования [1 × реакционный буфер Thermolpol I / Na ₂ PdCl ₄ / P (PhSO ₃ Na) ₃ ] и инкубировали в течение 5 минут при 60 ° C.Затем чип немедленно погружали в 3 М трис · HCl-буфер (pH 8,5) и инкубировали в течение 5 минут при 60 ° C. Наконец, чип промывали смесью ацетонитрил / dH ₂ O (1: 1 по объему) и dH ₂ O. Поверхность чипа снова сканировали для сравнения интенсивности флуоресценции после деаллилирования с исходной интенсивностью флуоресценции. За этим процессом последовала следующая реакция удлинения полимеразы с использованием 3′- O -аллил-dNTPs-аллил-флуорофора и 3′- O -аллил-dNTP, с последующими процессами промывки, флуоресцентного обнаружения и деаллилирования, выполняемыми как описано выше.Тот же цикл повторяли несколько раз с использованием смеси четырех химически расщепляемых флуоресцентных нуклеотидов в реакции полимеразного удлинения для получения данных секвенирования ДНК de novo на различных различных ДНК-матрицах.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами P50 HG002806 и R01 HG003582 Национальных институтов здравоохранения и грантами Packard Fellowship for Science and Engineering.

Сноски

• ^‡ Кому корреспонденцию можно направлять по адресу:
  , комната 405A, Павильон медицинских наук Расс Берри, Колумбийский центр генома, Колледж врачей и хирургов Колумбийского университета, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк 10032.
  Эл. Почта: ju {at} c2b2.columbia.edu или njt3 {at} columbia.edu

• Вклад авторов: J.J. и N.J.T. спланированное исследование; D.H.K., L.B., Q.M., X.B., Z.L., X.L., M.S.M., S.S., J.W., J.R.E. и A.R. проведенное исследование; и J.J., D.H.K. и Q.M. написал газету.

• Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

• Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/cgi/content/full/0609513103/DC1.

• Сокращения:

  SBS,

  секвенирование путем синтеза;

  бодипи,

  4,4-дифтор-4-бора-3α, 4α-диаза-s-индацен;

  ROX,

  6-карбокси-X-родамин;

  R6G,

  6-карбоксиродамин-6G.

• Свободно доступен онлайн через опцию открытого доступа PNAS.

• © 2006 Национальная академия наук США

Раскраска «Терминатор: один выстрел и безмятежность»

|

Dark Horse прислала нам несколько эксклюзивных страниц предварительного просмотра двух книг, которые поступят в продажу 11 октября.Сначала идет The Terminator: The Original Comics Series — Tempest One-Shot by John Acrudi , James Robinson , Chris Warner и Matt Wagner . А для чего-то другого, у нас есть страницы из Serenity: Everything’s Shiny Adult Coloring Book . В него входят Стивен Бирн , Пабло Чурин , Уилл Конрад , Джордж Жанти , Хуан Фригери и Тейлор Роуз .

ТЕРМИНАТОР: ОРИГИНАЛЬНАЯ СЕРИЯ КОМИКСОВ – ТЕМПЕСТ И ОДИН ВЫСТРЕЛ HC
Сценарист: Джон Аркуди, Джеймс Робинсон | Художник: Крис Уорнер, Мэтт Вагнер | Инкер: Пол Гинан | Колорист: Крис Челенор, Рашель Менаше

Бессердечная механическая жестокость встречается с упорным человеческим мужеством и упорством в самой первой истории Терминатора от Dark Horse! Джон Коннор отправляет ударную группу в прошлое, чтобы уничтожить Cyberdyne. Но машины противостоят, отправив команду терминаторов, чтобы заблокировать попытку — превратив Лос-Анджелес в зону боевых действий! В этом томе собраны «Терминатор № 1–4» («Буря») и «Терминатор: один выстрел» писателя Джеймса Робинсона и художника Мэтта Вагнера!

Безмятежность: блестящая раскраска для взрослых TPB
Художники: Стивен Бирн, Пабло Чурин, Уилл Конрад, Жорж Жанти, Хуан Фригери, Тейлор Роуз

Основанные на космической пиратской команде создателя Джосса Уидона и всех элементах их футуристической, вдохновленной вестерном вселенной, оригинальные иллюстрации в этом томе прославляют персонажей, места и суть всего, что началось в культовых классических телесериалах Firefly и продолжение в фильме «Безмятежность».* Включает 45 оригинальных черно-белых изображений с высокой детализацией для раскрашивания!

Размещено в: Комиксы | Tagged: Комиксы, темная лошадка, развлечения, HRL, Джеймс Робинсон, безмятежность, терминатор

Iterm Themes — Цветовые схемы и темы для Iterm2

Введение

Это набор цветовых тем для iTerm (он же iTerm2). Скриншоты ниже и в каталоге скриншотов.

Инструкции по установке

Для установки:

• Запустите iTerm 2.Загрузите последнюю версию на iterm2.com
• Тип CMD + i
• Перейдите на вкладку Цвета
• Нажмите «Загрузить предустановки»
• Нажмите «Импорт»
• Выберите файл (ы) .itermcolors схемы (ов), которую вы хотите использовать
• Щелкните Загрузить предустановки и выберите цветовую схему

Установка X11 и конфигурация терминатора

См. Файл README для получения инструкций по установке тем в X11 и Terminator

Скриншоты

3024 День

3024 Ночь

Приключения

Время приключений

послесвечение

Чужая кровь

Андромеда

Аргонавт

Артур

Ателье Сульфурпул

Атом

AtomOneLight

Аврора

аю

аю_лайт

Аю Мираж

Банан Черника

Бэтмен

День Белафонте

Белафонте Ночь

Птицы рая

Блейзер

BlueBerryPie

Голубой дельфин

Синяя матрица

Bluloco Темный

BlulocoLight

Borland

Бриз

Яркий свет

Радиовещание

Брограммер

Встроенный темный

Встроенный светильник

Builtin Pastel Dark

Встроенная солнечная темнота

Встроенный солнечный свет

Встроенный Tango Dark

Встроенный светильник Tango

C64

Бедствие

Мел

Классная доска

ChallengerDeep

Честер

Чапре

CLRS

Кобальт2

Кобальтовый неон

Кофе

МелокPonyFish

Cyberdyne

киберпанк

Пастель темная

Темный +

Дарксайд

глубокая

Пустыня

Затемненный Монокай

Джанго

DjangoRebornAgain

DjangoSmooth

DoomOne

Роковой павлин

DotGov

Дракула

Дракула +

Дуотон Темный

Песня Земли

Элементаль

Начальный

ENCOM

Эспрессо

Либре эспрессо

по Фаренгейту

Фиделопер

FirefoxDev

Firewatch

FishTank

плоский

Равнинная

Floraverse

Голубой

Фреймер

FrontEndDelight

FunForrest

Галактика

Галицур

Github

Ледник

Виноград

Трава

Грувбокс Темный

Gruvbox Light

Guezwhoz

Hacktober

Хардкор

Харпер

шоссе

Зеленый хипстер

Hivacruz

Домашнее пиво

Классики

Классики.256

Уртадо

Гибрид

IC_Green_PPL

IC_Orange_PPL

идея

холостой ход

IR_Черный

Джеки Браун

Японский

Мармелад

JetBrains Darcula

Юби

Kibble

Колорит

Консолас

Lab Fox

Лазер

Позже этим вечером

Лаванда

Жидкий углерод

Жидкость Углеродная Прозрачная

Жидкость Углерод Прозрачный Обратный

ловелас

Человек Страница

Мариана

Материал

Материал Темный

Материал Темнее

Материал Ocean

Матиас

Медальон

полночь в Мохаве

Мираж

Misterioso

Молокаи

МонаЛиза

Monokai Remastered

Монокай Сода

Яркий Монокай

N0tch3k

Неополитан

Нейтрон

Ночной Сов Свет

NightLion v1

NightLion v2

Ночная зима

норд

Роман

Обсидиан

Океан

OceanicMaterial

Олли

OneHalfDark

OneHalfLight

Оператор Моно Темный

Ночной сон

PaleNightHC

Пандора

Темный Parasio

PaulMillr

Карандаш Темный

Подсветка для карандашей

Piatto Light

Пневма

Выталкивание и запирание

первичный

Pro

Про свет

Пурпурный дождь

пурпур

Восторг

Raycast Темный

Raycast Свет

Ребекка

Красный сигнал тревоги

Красная планета

Красные пески

Расслабленный

Rippedcast

Руж 2

Королевский

Рюуко

Сакура

Алый протокол

Пастель Seafoam

Морские ракушки

Сети

оттенков фиолетового

Шаман

шифер

Слипи-Холлоу

Smyck

Элегантный

SoftServer

Солнечная Даркула

Solarized Dark Более контрастный

Solarized Dark — исправлено

Космическая пыль

SpaceGray

SpaceGray восьмидесятые

SpaceGray Eighties Тусклый

Человек-паук

Пружина

Квадрат

Сублета

Подсознательный

Сушеные

Symfonic

синтвейв

Synthwave-все

Tango адаптировано

Tango Half Adapted

Половинная адаптация к танго

Тирб

Терминал Basic

Тайер Брайт

Халк

Tinacious Design (Темный)

Tinacious Design (легкий)

Завтра

Завтра ночью

Tomorrow Night Синий

Яркая завтрашняя ночь

Завтра ночью ожоги

Завтра ночью восьмидесятых

Ящик для игрушек

Дом на дереве

Сумерки

Ubuntu

Ультратемный

Ультра насильственные

Подводное море

Юникитти

Урпл

Вон

Яркие чернила

Темно-фиолетовый

Фиолетовый свет

теплый неон

Вез

Причуды

Дикая вишня

Вомбат

Райан

Зенбурн

Кредиты

Темы Novel, Espresso, Grass, Homebrew, Ocean, Pro, Man Page, Red Sands и Terminal Basic являются портами тем с тем же названием, включенных в приложение Mac Terminal.Все темы Терминала теперь перенесены, за исключением «Сплошных цветов» (случайные фоны, которые iTerm не поддерживает) и «Аэрогель» (что отвратительно).

Схема idleToes была вдохновлена ​​темой idleFingers TextMate и предложена для включения Сетом Уилсоном.

Схема Zenburn была вдохновлена ​​версией Zenburn, созданной Сураджем Н. Курапати.

Схема Symfonic была вдохновлена ​​цветовой схемой, используемой в документации для Symfony PHP Framework.

Схема Solarized Darcula была вдохновлена ​​цветовой темой, созданной @rickhanlonii] .. Ниже представлены два скриншота; один с фоном и один без. Фоновое изображение включено в каталог background /, и изображение необходимо вручную установить на вкладке «Настройки» профиля -> «Окно». На скриншоте это сложно увидеть, но выглядит отлично!

Здесь была найдена тема Hurtado.

Здесь была найдена тема Monokai Soda.

Тема Neopolitan была создана Daytonn

Темы Solarized Dark и Solarized Light взяты с официального веб-сайта Solarized

Обсидиановая тема была на моем жестком диске, и я не помню, откуда она взялась.Если кто знает, пингуйте меня, и я сделаю ссылку на автора (авторов).

Тема Spacedust была создана mhallendal и перенесена на iTerm Couto

Тема Mathias была создана mathiasbynens

Темы LiquidCarbon были созданы markcho

Темы NightLion были созданы Curvve Media

Темы «Завтра» были созданы Крискемпсоном

Тема «Сумерки» была создана stefri

Тема Teerb была создана Teerb

Тема IR_Black была найдена здесь

Тема Misterioso была создана flooose

Гибридная тема была найдена здесь

Тема Thayer Bright была найдена здесь

Тема Spring была найдена здесь

Тема Smyck была найдена здесь

Тема Cobalt2 была создана wesbos

Тема WarmNeon была перенесена из PyCharmby firewut

Тема SpaceGray создана ryentzer

Тема Jellybeans была создана qtpi

Тема PaulMillr была создана paulmillr и перенесена на iTerm мной

Тема Harper была создана idleberg

Тема CLRS была создана jasonlong

Тема Дракулы была создана zenorocha

Темы AdventureTime, AlienBlood, BirdsOfParadise, Ciapre, CrayonPonyFish, DimmedMonokai, Earthsong, Elemental, FishTank, FrontEndDelight, FunForrest, Grape, Highway, IC_Green_PPL, IC_Orange_PPL, Lavandula, Sundhells, Royal, Медальон , Treehouse, Urple были созданы zdj

Японская тема была создана aereal

Тема Сети была создана jesseweed и перенесена на iTerm 2 Филдуффи и немного изменена, чтобы сделать черные цвета ANSI немного более контрастными.

Темы Hipster Green и Джеки Браун были созданы Ункулункулу

Тема Chalk создана achalv

Темы Pencil Dark и Pencil Light созданы mattly

Тема Flat была создана ahmetsulek

Темы Atom, Brogrammer, Glacier и Darkside были созданы bahlo

Тема послесвечения была создана yabatadesign

Тема Broadcast создана vinkla

.

Темы Arthur, N0tch3k, Pnevma, Square и Wryan были созданы baskerville

Темы Belafonte Day, Belafonte Night, Paraiso Dark и C64 были созданы idleberg

Темы 3024 Day и 3024 Night были созданы с помощью 0x3024

Тема «Аргонавт» создана effkay

.

Тема Espresso Libre была создана jurgemaister

Тема Hardcore была создана hardcore

Тема Rippedcasts была создана mdw123

Тема Solorized Dark Higher Contrast была создана грабителями

Тема VibrantInk была создана asanghi

Тема Wez была создана wez

Тема Wombat была создана djoyner

Тема WildCherry была создана mashaal

Тема Flatland была создана realchaseadams

Тема Neutron была создана Ch5s3

Тема Fideloper была создана Fideloper

Тема Galaxy была создана jglovier

Тема «Позднее этим вечером» создана vilhalmer

Если есть другие цветовые темы, которые вы хотели бы включить, напишите мне!

Тема Slate создана deneshshan

Темы SpaceGray Eighties и SpaceGray Eighties Dull были созданы mhkeller

Тема Borland была создана delip

Тема Cobalt Neon была создана vasquex

Тема AtelierSulphurpool была создана atelierbram

Темы «Бэтмен», «Человек-паук» и «Халк» созданы с помощью пирофоса

Тема ENCOM была создана Джошем Брауном

Тема Floraverse была создана papayakitty

Темы Material и Material Dark были созданы stoeffel

.

Тема OceanicMaterial была создана rahulpatel

Тема AtomOneLight создана iamstarkov

Тема Piatto Light создана kovv

Тема DotGov была вдохновлена ​​цветовой палитрой, используемой в U.S. Стандарты веб-дизайна

Тема Duotone Dark была создана chibicode на основе темной темы Atom от simurai

Тема JetBrains Darcula была создана vitstr

Тема «Яркие огни» создана tw15egan

Марианская тема была адаптирована из одноименной темы Sublime Text.

Тема Ayu Mirage была адаптирована из одноименной темы VS Code.

---

Цветовые схемы iTerm | Цветовые схемы iTerm2 | Цветовые схемы iTerm 2 | Темы iTerm | Темы iTerm2 | iTerm 2 шаблоны

Минутку…

Пожалуйста, включите куки и перезагрузите страницу.

Это автоматический процесс. Ваш браузер в ближайшее время перенаправит вас на запрошенный контент.

Подождите до 5 секунд…

Перенаправление…

+ ((! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + []) + (! + [] + (!! []) — []) + (! + [] — (!! [])) + (! + [] + (!! []) +! ! [] + !! []) + (+ !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) — []) + (! + [] + (!! []) + !! [])) / + ( (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + []) + (! + [] + (!! []) — []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) — []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [ ] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] ) + (! + [] — (!! [])) + (+ !! []))

+ ((! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + []) + (+ !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] — (!! [])) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! [] ) — []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [])) / + ((! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! []) + (! + [] — (! ! [])) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! []) + (! + [] — (!! [])) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) »

+ ( (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [ ] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + []) + (+ !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [ ] + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] ) + (! + [] — (!! [])) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! [ ]) — []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [])) » / + ((! + [] + (!! []) + !! [] + []) + (! + [] — (!! [])) + (! + [] + (!! [] ) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! []) + (! + [] — (!! [])) + (+ !! []) + (+! ! []))

+ ((! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [ ] + []) + (! + [] + (!! []) + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] — (!! [])) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! []) + (+ !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + ( ! + [] + (!! []) + !! [] + !! []) + (+ !! [])) / + ((! + [] + (!! []) + !! [ ] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + []) + (! + [] — (!! [])) + (! + [] + (!! []) — []) + (+ !! []) + (! + [] — (!! [])) + (! + [] + (!! [] ) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] — (!! []) ) + (! + [] + (!! []) — []) + (! + [] + (!! []) + !! []))

+ ((! + [] + (! ! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + []) + (+ !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) +! ! [] + !! [] + !! []) + (! + [] — (!! [] )) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) — []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [])) / + ((! + [] + (!! [ ]) — [] + []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [ ] + !! []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] + (!! []) — []) + (! + [] + (!! []) + !! [] + !! [] + !! [ ] + !! [] + !! [] + !! []) + (! + [] — (!! [])) + (! + [] — (!! [])) + (+ !! []))

.