Сложные рисунки по клеточкам в тетради картинки: Сложные рисунки по клеточкам ? фото 100 креативных идей

рисунки по клеточкам сложные и красивые в тетради

вот например еда из макдональдса гамбургер. достаточно выбрать рисунок и начать.

Krasivye Kartinki Po Kletochkam V Tetradi Smotret Besplatno 15

нарисовать какую нибудь прикольную вкусняшку по клеточкам тоже несложно.

рисунки по клеточкам сложные и красивые в тетради. рисунки по клеточкам в тетради отличный способ научиться рисовать. берите эти легкие рисунки и буквально за 5 минут на вашим листе появится веселый и озорной образ. сложные и красивые рисунки по клеточкам помогают не просто интересно провести время на скучном уроке но и красиво оформить тетрадь в клетку например для личного дневника.

сегодня у меня творческая тема в которой я вам расскажу и поэтапно покажу что такое рисунки по клеточкам в тетради они будут легкие и сложные на разные темы и для разного возраста. для такого рисования не требуются особые навыки. это также отличное развивающее и.

сложные рисунки по клеточкам в тетради помогут развеять скуку и с интересом провести время проявляя свое творчество. рисунки по клеточкам в тетради для девочек. рисунки по клеточкам в тетради для девочек.

скоротайте время с пользой а потом удивите всех.

Risunki Po Kletochkam V Tetradi Kartinki Slozhnye Legkie S

Risunki Po Kletochkam Shemy Pikselnye Risunki Piksel Art

Pin Ot Polzovatelya Lida Firsova Na Doske Risunki Po Kletkam

Kak Risovat Koronu Po Kletochkam Risunki Po Kletochkam Pixel Art

Risunki Po Kletochkam Pikselnye Izobrazheniya Minecraft Risunki

Risunki Po Kletochkam S Izobrazheniyami Risunki Piksel Art

Kartinki Po Zaprosu Risunki Po Kletochkam V Tetradi S

Risunki Po Kletochkam V Tetradi Multyashnye Risunki Pikselnye

Resultado De Imagen Para Risunki Po Kletochkam Risunki Idei Dlya

Risunki Po Kletochkam V Tetradi Slozhnye Termomozaika Pikselnye

Risunok Popugaya Po Kletochkam Pikselnye Izobrazheniya Minecraft

Risunki Po Kletochkam Slozhnye S Izobrazheniyami Poperechnye

Risunki Na Polyah Tetradi Foto 9 Tys Izobrazhenij Najdeno V Yandeks

Risovat Po Kletochkam Prostye I Slozhnye Kartinki Shema S

Risunki Po Kletochkam 67 Tys Izobrazhenij Najdeno V Yandeks

Risunki Po Kletochkam V Tetradi S Izobrazheniyami Risunki Slona

Risunki Po Kletochkam 19 Tys Izobrazhenij Najdeno V Yandeks

Kartinki Po Kletochkam Devushki S Izobrazheniyami Risunki

Pin Ot Polzovatelya Nigai Na Doske Chelo Risunki Pikselnye

Картинки для срисовывания по клеточкам – Ой!

Рисунки для срисовки по клеточкам (30 картинок)

Вы пробовали хоть раз рисовать по клеточкам? Это самый простой способ нарисовать красивую картинку, не имея навыков рисования. Здесь изображены разные рисунки для срисовки по клеточкам.

Мороженое

Кошка на луне

Мышка

Попугайчики

Птичка

Меч

Пирожное

Смайл с сердцем

Кроссовок

Смайл

Медвежонок

Пингвин

Дерево

Красивый мишка

Котик

Любовь

Картошка Фри

Рожок

Яблоко

Попугайчик

Монстр

Туфли

Бургер

Тортик

Конфетка

Долька Арбуза

Бабочки

Сова

Love

Микки Маус

Популярные материалы

funpick.ru

красивые, интересные, легкие и сложные рисунки в тетрадь

Большую популярность в последнее время набирает рисование по клеткам. Чтобы вы всегда знали, что нарисовать и часами не искали новые идеи, мы приготовили картинки для срисовки по клеточкам. Раньше такие изображения чаще встречались в схемах для вышивки, а сейчас украшают тетради для рисования. Эти «пиксельные» изображения стали востребованы как у детей, так и у взрослых. С помощью пикселей создаются интересные картины с символами, животными, предметами и людьми.

Рисунки по клеточкам

Срисовывать рисунки по клеточкам не сложно. Так как все представленные картинки черно-белые, вам понадобится простой карандаш и тетрадь или листик в клетку. Затем выбирайте любой понравившийся рисунок, внимательно на него смотрите и начинайте поэтапно срисовывать.

Рисунки для срисовки по клеткам, которые мы отобрали очень разные. Среди них много животных, мультяшных персонажей и даже портрет. И если вам сложно представить, как это выглядит нарисованным по клеточкам, посмотрите на эти красивые картинки и убедитесь, что весьма оригинально и необычно.

Нарисованные картинки по клеточкам украсят ваши тетради и превратят их в художественные альбомы, главное не рисуйте в школьных тетрадях и на уроках, учителя не оценят вашу тягу к прекрасному.

Рисуя красивые рисунки по клеточкам с детьми, вы будете развивать у ребенка логическое мышление, внимание и аккуратность. А заодно и математику захватите, высчитывая где и в какой строке нужно рисовать.

На первый взгляд кажется, что все очень просто, считай, да рисуй. Так и есть, только нужно проявлять аккуратность и следовать строго по схеме. Упустив или переместив один квадратик, может потеряться правильность всего изображения.

Легкие рисунки по клеточкам

Для начинающих kakrisovat.com подготовил самые простые рисунки карандашом для срисовки по клеточкам. Они очень легкие и содержат в себе лишь контур изображения. Поэтому вы точно сможете нарисовать их, а потом перейти к более сложным рисункам.

Здесь главное понять принцип и сразу не запутаться в большом количестве квадратиков. Тогда срисовки пойдут легко, будете создавать несколько за один вечер. Конечно первое время вы можете постоянно искать для срисовки карандашом легкие картинки и только когда будете уверенны в себе на все сто, перейдете на сложные в перерисовывании изображения.

Мы собрали картинки разной сложности, так что вам будет куда расти и развиваться. Можете выбрать любой рисунок и проверить свои силы художника уже сейчас. Запасайтесь тетрадями, карандашами, ластиком и точилкой, мы знаем, что вас затянет и остановится будет трудно.

kakrisovat.com

Как картинки рисовать по клеточкам?

Разнообразьте свой личный дневник или тетрадь в клеточку красивыми картинками. Наиболее интересные картинки для срисовки по клеточкам представлены ниже:

www.ejin.ru

Рисунки для срисовки по клеточкам в тетради карандашом для начинающих (600 рисунков)

Ты открыл новый раздел срисовки по клеточкам. Тогда мы с тобой подружимся, ведь у меня есть специально тебе подобрали картинки для срисовки по клеточкам.  Все эти красивые и крутые рисунки для срисовки по клеточкам будут отлично смотреться в твоей тетради, только, пожалуйста, не рисуй в тетрадках по математике, а то математичка будет недовольна. Кстати, рисунки по клеточкам в тетради можно выполнять и ручкой, и карандашом, и фломастером, и даже маркером. В общем используй все, что у тебя есть под рукой. Нас с тобой ждут великие дела!

Картинки для срисовки по клеточкам простые и легкие уже давно ждут тебя в этой галерее.

Как найти нужный рисунок для срисовки по клеточкам

• Выбирай нужную картинки ниже в галерее,
• Чтобы увеличить картинку просто кликни по ней,
• В открывшемся окне можно распечатать, скачать ее на свой компьютер.

Срисовки по клеточкам можно выполнять прямо с экрана монитора.

Скачать и распечатать рисунки для срисовки по клеточкам на любой вкус

Вам так же могут понравится другие срисовки:

Отборные рисунки срисовки для мальчиков разных возрастов

Картинки для срисовки для девочек от 1 года до 99 лет

Топовые рисунки еды для срисовывания

Картинки срисовки карандашом, сложные, легкие

Красивые кавайные картинки в срисовках

Картинки срисовывания в личный дневник

Картинки для срисовок девушек сложных и легких

Герои фнаф в срисовках

Картинки для срисовки аниме стиля

Срисовки животных

Черное белые рисунки срисовывания — Лучшие в России

Срисовки единорогов от самых простых до сложных

Милые картинки для срисовки

Няшные картинки для срисовки

Срисовки прикольные

Герои Гравити фолз в рисунках срисовывания

Только лучшие срисовки в скетчбук или арт бук

Арты в виде рисунков срисовок

Вид рисунков Тумблер для перерисовывания

www.trend-city.ru

Легкие рисунки по клеточкам – рисуем быстро и просто!

Можно ли нарисовать классную картинку быстро и просто? Да! Легкие рисунки по клеточкам сможет нарисовать каждый – даже не обладая особыми способностями! Правда-правда! С помощью клеточек можно нарисовать все, что захочется – от очень маленьких элементов и фигур, до огромных картин, похожих больше на произведение искусства, чем на любительский рисунок!

Впрочем, вы, наверняка, это знаете, если любите рисовать по клеточкам! А если вы еще не пробовали это делать, самое время начать! На этом этапе лучше всего использовать самые простые схемы, постепенно переходя к более сложным. Итак! Вперед, за цветными карандашами или фломастерами, и листочком бумаги в клетку!

Легкие рисунки по клеточкам – образцы для перерисовки

Автор записи: admin

pro-kletochki.ru

Картинки для срисовки по клеточкам

Картинки для срисовки по клеточкам – лучший способ познать азы мастерства и набить руку.
Уметь красиво рисовать хочется всем. Но не каждый знает, что сегодня есть возможность этому научиться. Впоследствии можно без труда рисовать все, что пожелается, не испытывая особых сложностей. На самом деле техника рисования доступна для познания и освоения для всех. При этом необязательно обладать сверхталантом. Срисовывая по клеточкам изображения, можно реально испытать настоящее удовольствие и от этого занятия. Вы довольно быстро освоите все главные правила техники рисования, срисовывая такие картинки.

kartik.ru

Картинки для срисовки по клеточкам (40 фото) ⭐ Забавник

Подборка картинок, которые сможет нарисовать каждый. Картинки, нарисованные по клеткам. Такие картинки прекрасно подойдут для личных дневников. Приятного просмотра.

Кот с розовыми щеками

Череп с розовым бантиком

Розовая сова

Щенок вытащил язык и сердечко возле него

Черный и белый кот, любовь

Красное сердце

Два папугая

Змея вытащила язык

LOVE

фиолетовый лебедь

Голова коня

Мордочка свиньи

Кусок арбуза

Панда на траве сидит,вокруг нее сердечки

Девушка на занятие йоги

Голубая чашка

Котенок на месяце

Покемон

Новогодняя елка

Морда кота, кошка сидит и цветок

Цифра 3 на руке

Ам-Ням

Желтый треугольник с глазом

zabavnik.club

Надоело напоминать ребенку про уроки и домашние дела? Советы, которые помогут

Даже в средней (и старшей!) школе находятся родители, которые спрашивают в чатах, что задавали на дом. Многих это возмущает, а многие воспринимают как норму. Если вам роль «родителя-напоминателя» не близка, можно задаться целью и с детства научить ребенка нести ответственность за свои дела. Как это сделать, рассказала консультант по тайм-менеджменту и мама троих детей Елена Босякова.

Принципы тайм-менеджмента обычно используют взрослые люди, но обучать правильному планированию можно и детей. В этом есть масса плюсов:

— Ребенок учится выделять приоритеты и осознавать, какие дела важные (значит, их нужно сделать в первую очередь), а какие — второстепенные. Он учится самостоятельно ставить перед собой цели и идти к ним, разделяя их на более простые шаги. И тогда даже самые сложные цели, которые казались ребенку неосуществимыми, становятся простыми и понятными.

А еще с помощью тайм-менеджмента ребенок учится грамотно выделять время на отдых, что особенно актуально для современных детей.

— Часто родители ставят занятия ребенка слишком плотно друг к другу, не осознавая, что это тяжело для школьника. Составляя план на день/неделю самостоятельно или с помощью родителей, ребенок сам определяет, когда ему нужен отдых и в каком количестве. Это позволит избежать перегрузки.

Полезно и то, что в ходе планирования ребенок сможет увидеть «пожирателей» времени, из-за которых он не успевает вовремя выполнять запланированные дела. Например, долгое зависание в телефоне или мультиках.

А в чем же выгода для родителей? Ребенок становится более самостоятельным: он учится управлять своим временем, начинает понимать, что для него важно и значимо, какие шаги на пути к своей цели он должен пройти.

— И вам не нужно его постоянно дергать: «А сделал ли ты уроки?», «А не опоздаешь ли ты на тренировку?». Ребенок сам понимает, куда и когда ему надо идти и что делать. Это ли не счастье для родителей?

Начинать можно чуть ли не с года, когда мы учим ребенка складывать игрушки. После 2−3 лет можно визуализировать режим дня. Например, можно повесить на стену лист со схематическими рисунками: утренние гигиенические процедуры — завтрак — игры на улице — обед — дневной сон — полдник — игры с мамой — ужин — вечерние гигиенические процедуры — ночной сон. Так ребенку проще будет запомнить, что и когда нужно делать в течение дня.

— Например, с моими детьми мы составили четкий план, что и в какой очередности надо выполнять перед сном. Дети у меня разного возраста: 3, 5 и 7 лет, и младшие еще не умеют читать, потому я написала список дел, а рядом с каждым пунктом нарисовала значок. Теперь мне не нужно ходить и каждый вечер говорить: «Уберите одежду, соберите вещи для школы и сада, сходите в ванную и т.д.» Дети смотрят на список дел, который висит у них в комнате, и последовательно все выполняют.

Более основательно к обучению тайм-менеджмента можно подходить с началом школы или за год до нее — в это время многие дети начинают ходить на подготовительные занятия и кружки, а значит, появляются дела, за которые нужно нести ответственность.

Купите вместе с ребенком красивую тетрадь и объясните ему, что в нее он должен записывать с вечера все дела, запланированные на завтра. На это обычно уходит не более 10 минут. Таким же планированием можно заниматься в воскресенье вечером, чтобы распределить дела на неделю.

— Ребенок должен осознать, что если у него возникло какое-то важное дело, его нужно сразу же записать в тетрадь. Держать все в памяти просто невозможно, особенно это касается детей: у них столько мыслей и идей, что из головы моментально все «вылетает». Лучше начинать с малого — сначала будет достаточно 2−3 дел в день. Если ребенок будет справляться с их выполнением, постепенно можно увеличивать количество пунктов в списке. Помните: важен не сам факт планирования дел, а чтобы они вовремя выполнялись. Поэтому на первых порах помощь родителей очень важна.

Если вариант с тетрадью ребенку не понравится, можно сделать мини-план на неделю и прикрепить его на доску над столом. Так вся информация у школьника будет перед глазами. Старшеклассники могут использовать простые варианты планировщиков в смартфоне.

«Жесткие дела» привязаны ко времени: уроки, кружки, посещение бассейна, занятия с репетитором, домашние задания — их можно сразу внести в план на неделю. После этого ребенок может добавить в свой план «гибкие дела», например, встречу с друзьями или поход в кино.

— Глядя на план, заполненный жесткими делами, школьник будет понимать: завтра у меня весь день занят, а вот послезавтра есть свободное время с пяти до семи, поэтому я могу сходить в кино с друзьями.

Источник фото: pexels.com

Кроме ежедневного планирования в тетради можно отвести пару страниц под контекстное планирование — дела, которые привязаны к определенным условиям («контексту»). Например, это может быть страница «Дела на каникулах».

— Туда ребенок будет записывать то, что хочет сделать на каникулах без указания даты и времени. А когда каникулы будут уже «на носу», он вернется к этим страницам и разбросает дела по датам и времени. Так ему не надо будет держать свои планы в голове, и он сможет уделить внимание чему-то другому. А главное — он насыщенно проведет время на каникулах.

Объясните ребенку, что не стоит планировать дела буквально поминутно, ведь бывают форс-мажоры, которые от нас не зависят. И это нужно учитывать. Вот почему не стоит заполнять план полностью: 30−40% времени — это пространство для маневров, подчеркивает специалист.

— Если у ребенка внезапно возникнут срочные дела, то он без проблем сможет вписать в их план и выполнить. В противном случае у него может появиться недовольство собой из-за того, что у него не получается сделать все запланированное на день. И ребенок может забросить планирование в принципе.

Научите ребенка использовать цвет при планировании: так он будет видеть, какие дела он уже выполнил, а какие ему еще предстоят. Например, сверхважные дела, которые нужно сделать вовремя, можно выделять красным цветом, а выполненные — зачеркивать синим. Кроме того, можно выделять цветом задачи по их типу, например, уроки подчеркивать желтым, спортивные кружки — зеленым и т.п. Благодаря ярким цветам планирование станет для ребенка веселым занятием, ведь многие дети любят рисовать красочными текстовыми выделителями.

Что делать, если к вечеру в плане останутся невыполненные дела? Специалист советует не ругать ребенка, а вместе с ним определить, можно ли их сделать сейчас или перенести на завтра. Если ситуацию уже не исправить, обязательно рассказать ребенку о последствиях: «Вот ты не сделал домашнее задание на понедельник, теперь на выходных придется этим заниматься вместо поездки за город». Ребенок не должен переносить ответственность на родителей, нужно учить тому, что за свои действия он отвечает сам. Это один из шагов на пути к самостоятельности.

— Бывает полезно показать ребенку на деле эти последствия. Если ребенок забыл сделать домашнее задание, пуcть идет в школу и увидит, к чему это может привести. А постоянное мамино напоминание: «Не пора ли делать уроки?» никак не простимулирует ребенка. Это скорее «белый шум», к которому дети привыкают и на который не реагируют (особенно, если это происходит каждый день).

Специалист советует обсуждать с ребенком, почему у него не получается выполнять все запланированные дела. Возможно, не хватает сил, поскольку активностей слишком много? Может, часть нагрузки нужно распределить на выходные? Или, наоборот, освободить выходные для отдыха? Все эти вопросы помогут спланировать время правильно.

Привить ребенку принципы тайм-менеджмента эффективнее на собственном примере: ведь дети перенимают поведение и образ жизни родителей и неосознанно переносят это в свою жизнь. «Если в семье не планируют дела, то требовать от ребенка правильно распоряжаться своим временем — глупо», — убеждена эксперт.

Заведите общесемейный план. В него вписывайте все совместные мероприятия, в которых участвуют дети. Такой график можно повесить на холодильнике, чтобы каждый член семьи мог в любое время его посмотреть.

Источник фото: unsplash.com

Чтобы ребенку хотелось каждый день планировать свои дела, его нужно мотивировать. Делать это можно самыми разными способами.

Например, можно клеить в тетрадь мотивационные наклейки. За определенное количество собранных наклеек можно придумать для ребенка какое-то поощрение, например, поход в кино. «Лучше, чтобы это было какое-то совместное времяпрепровождение, а не очередная игрушка», — советует специалист.

Для дел, которые повторяются изо дня в день, можно составить трекер привычек. Он представляет собой мини-календарь с кружочками или клеточками, которые нужно закрашивать, если сегодня дело выполнено. Можно использовать для этого несколько цветов, поощряя отличное выполнение дела: например, закрашивать строчку желтым, когда ребенок просто выполнил задание, а зеленым — когда он сделал это на «отлично». А в конце вписать или нарисовать какое-то долгожданное событие для ребенка. Это будет его мотивацией для выполнения плана.

Чтобы такой план не показался ребенку слишком сложным, можно оговорить количество «пропусков», когда он может не выполнять задание по собственному желанию (например, не более двух раз).

— Подобное я делала для своих дочерей. Летом они должны были выполнять логопедические упражнения. Делать им это не очень хотелось, и я придумала для них план в виде трекера привычек. Мы договорились о «плюшке» в конце каждого периода — покататься на лошадях и съездить в веревочный городок. Они выполняли задание и закрашивали кружочки, постепенно приближаясь к своим желаниям. То, что они видели цель, — очень мотивировало и дисциплинировало девочек.

Для детей помладше можно сделать трекер привычек в игровой форме. Например, в виде настольной игры: нарисовать на листке цепочку из квадратиков или кружочков в виде пути. В начале пути схематично изобразить ребенка, а в конце — клад (им может быть какое-то поощрение). Ребенок будет выполнять дела, постепенно зачеркивая клеточки и таким образом приближаться к кладу.

Если ребенок любит соревноваться, то ему можно предложить игру «Какой счет?» Скажите утром: «Пока у тебя счет 5:0 в пользу невыполненных дел. Интересно, какой счет будет вечером?» Обычно дети с удовольствием участвуют в подобных соревнованиях.

В тайм-менеджменте для взрослых есть некоторые хитрости, которые позволяют упростить планирование и достижение целей. Многим, например, знакома фишка с «лягушками» и «слонами» — она отлично подойдет для детей.

«Съесть лягушку лучше с утра»: объясните ребенку, что когда у него есть какое-то неприятное дело, то его лучше выполнить утром, когда он полон сил. Сделав дело первым по списку, ребенок почувствует облегчение и удовлетворение, а выполнение остальных задач пройдет более легко и просто.

Есть обратное понятие — «съесть ватрушку по утрам»: приятное дело, которое приносит смысл текущему дню. Его тоже можно планировать на утро.

— Если в плане есть лягушка, то лучше утром съесть ее и не вспоминать больше о ней. Если же лягушки в плане на сегодня нет, можно начинать утро с ватрушки, чтобы задать хороший тон дню, — поясняет Елена Босякова.

Во взрослом тайм-менеджменте есть такое понятие, как «делить слона на стейки»: разделять сложное дело на отдельные задачи и постепенно выполнять их. Вот как можно адаптировать этот принцип для детей: есть шоколадный слон, которого ты хочешь съесть, но он настолько большой, что его сначала нужно разделить на части.

— Этот принцип отлично работает, когда у ребенка есть глобальная цель, но он не знает, как ее достичь. Разбив ее на мелкие задачи, он сразу поймет, с чего ему надо начать и как двигаться дальше шаг за шагом.

Похожая техника — «метод швейцарского сыра». Она помогает идти к цели, выполняя небольшие задачи, как бы «выедая» дырочки из сыра:

— Пусть ребенок представит, что его долгожданная цель — это кусок сыра. И если его невозможно «съесть» сразу и полностью, то можно «выедать» из него дырочки, как мышка. Тут может не быть никакой логической последовательности между задачами. Главное, чтобы количество «дырочек» со временем становилось все больше.

С помощью таких образных ассоциаций ребенок поймет, что можно не бояться ставить перед собой сложные цели. Нужно просто разделять их на отдельные задачи и выполнять их поэтапно. Это сделает ребенка более самостоятельным и инициативным, а родителям позволит забыть о постоянном контроле над уроками и другими активностями ребенка.

Обнаружение и сегментация морфологически сложных эукариотических клеток на изображениях флуоресцентной микроскопии с помощью слияния пирамид

Abstract

Обнаружение и сегментация клеток макрофагов на изображениях флуоресцентной микроскопии представляет собой сложную задачу, в основном из-за скопления клеток, различий в форме и морфологической сложности. Мы представляем новый подход глубокого обучения для обнаружения и сегментации клеток, который включает ранее изученные функции ядра.Новое сочетание пирамид признаков для обнаружения и сегментации ядер с пирамидами признаков для обнаружения и сегментации клеток используется для повышения производительности набора данных микроскопических изображений, созданного нами и предоставленного для всеобщего использования, содержащего как ядра, так и сигналы клеток. Наши экспериментальные результаты показывают, что обнаружение и сегментация клеток значительно выигрывают от слияния ранее изученных характеристик ядра. Предлагаемая архитектура слияния пирамид функций явно превосходит современный подход Mask R-CNN для обнаружения и сегментации ячеек с улучшением относительной средней средней точности до 23. 88% и 23,17% соответственно.

Информация об авторе

Для анализа клеточной инфекции и изменений в морфологии клеток на изображениях флуоресцентной микроскопии требуется надлежащее обнаружение и сегментация клеток. При автоматизированном анализе изображений флуоресцентной микроскопии разделение сигналов в непосредственной близости является сложной задачей. Высокая плотность клеток или кластерные образования увеличивают вероятность таких ситуаций на клеточном уровне. Другое ограничение — обнаружение морфологически сложных клеток, таких как макрофаги или нейроны.Их неопределенная морфология вызывает проблемы с идентификацией при поиске небольших вариаций фиксированных форм. По сравнению с простым сегментированием цитоплазмы сегментация на основе экземпляров представляет собой гораздо более сложную задачу, поскольку требуется присвоение идентификатора экземпляра клетки каждому пикселю изображения. Мы представляем новый подход глубокого обучения для обнаружения и сегментации клеток, который эффективно использует канал ядра для улучшения сегментации и обнаружения клеток за счет включения ранее изученных функций ядра.Это достигается за счет слияния пирамид признаков для обнаружения и сегментации ядра. Эффективность оценивается на наборе данных микроскопических изображений, содержащих сигналы как ядра, так и клеток.

Образец цитирования: Korfhage N, Mühling M, Ringshandl S, Becker A, Schmeck B, Freisleben B (2020) Обнаружение и сегментация морфологически сложных эукариотических клеток на изображениях флуоресцентной микроскопии с помощью слияния пирамид признаков. PLoS Comput Biol 16 (9): e1008179. https: // doi.org / 10.1371 / journal.pcbi.1008179

Редактор: Дина Шнайдман-Духовны, Еврейский университет Иерусалима, ИЗРАИЛЬ

Поступила: 11.10.2019; Дата принятия: 22 июля 2020 г .; Опубликовано: 8 сентября 2020 г.

Авторские права: © 2020 Korfhage et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Набор данных доступен по адресу https://box.uni-marburg.de/index.php/s/N934NJi7IsvOphf. Код и модели доступны по адресу https://github.com/umr-ds/feature_pyramid_fusion.

Финансирование: Эта работа была поддержана HMWK (Исследовательский центр LOEWE SYNMIKRO и его исследовательский центр «Технологии скрининга и автоматизации», Исследовательский кластер LOEWE MOSLA и Исследовательский кластер LOEWE Medical RNomics), DFG (SFB / TR- 84 TP C01) и BMBF (например, Med CAPSYS, JPI-AMR, ERACoSysMed2 — SysMed-COPD).Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Это статья о программном обеспечении PLOS по вычислительной биологии .

Введение

Высокопроизводительная клеточная биология включает в себя такие методы, как анализ микроскопических изображений, микроматрицы экспрессии генов или полногеномный скрининг для решения биологических вопросов, которые иначе невозможно решить с помощью более традиционных методов [1].

Тем не менее, флуоресцентной микроскопии часто избегают в экспериментах с высокой пропускной способностью, поскольку полученные данные утомительны для анализа людьми или слишком сложны для анализа с использованием доступных инструментов обработки изображений. Однако флуоресцентная микроскопия дает информацию о субклеточной локализации, поддерживает морфологический анализ и позволяет проводить исследования на уровне отдельных клеток [2].

Ограничивающим фактором автоматического анализа изображений с помощью флуоресцентной микроскопии является разделение сигналов в непосредственной близости, независимо от того, исходят ли сигналы от соседних клеток или отдельных пятен.Высокая плотность клеток или образование кластеров увеличивают вероятность таких ситуаций на клеточном уровне [3], в то время как высокий фон или низкое пространственное разрешение усложняют проблему на уровне сигнала. Другое ограничение — обнаружение морфологически сложных клеток, таких как макрофаги или нейроны. Их неопределенная морфология вызывает проблемы с идентификацией при поиске небольших вариаций фиксированных форм.

Изображения флуоресцентной микроскопии, рассматриваемые в этой статье, получены в результате высокопроизводительного скрининга с целью анализа фенотипических изменений и различий в уровне бактериальной инфекции макрофагов после лечения.Чтобы проанализировать клеточную инфекцию и изменения в морфологии клеток, необходимо надлежащее обнаружение и сегментация клеток. При адгезии к поверхности эти клетки имеют тенденцию образовывать кластеры, демонстрирующие слабые изменения сигнала в областях, прилегающих к контакту клетки с клеткой. Эти ограничения препятствуют проведению надлежащего анализа с помощью обычного программного обеспечения для анализа микроскопии.

По сравнению с простым сегментированием цитоплазмы, сегментация на основе экземпляров представляет собой гораздо более сложную задачу, поскольку требуется присвоение идентификатора экземпляра ячейки каждому пикселю изображения.Рис. 1 показывает, что точное разделение и сегментация сгруппированных ячеек без какой-либо дополнительной информации чрезвычайно сложно, если вообще возможно. Даже для специалистов-людей правильное разделение отдельных клеток часто возможно только с использованием информации о ядре. Рис. 1 показывает, что учет сигнала ядра значительно облегчает идентификацию отдельных клеток.

В этой статье подход глубокого обучения к обнаружению и сегментации клеток, основанный на архитектуре сверточной нейронной сети (CNN), применяется к изображениям флуоресцентной микроскопии, содержащим каналы для ядер и клеток. Вклады статьи следующие:

• Мы предоставляем новый набор данных о клетках макрофагов для публичного использования, в том числе ограничивающие прямоугольники и маски сегментации для экземпляров клеток и ядер.
• Мы используем информацию о ядре в подходе глубокого обучения для улучшения обнаружения и сегментации клеток. Канал ядра используется для улучшения качества обнаружения и сегментации клеток. Насколько нам известно, это первый подход глубокого обучения, который использует дополнительную информацию ядра для улучшения обнаружения и сегментации клеток.
• Мы представляем архитектуру CNN, основанную на Mask R-CNN, и новую схему слияния пирамиды функций. Эта архитектура CNN показывает превосходную производительность с точки зрения средней средней точности по сравнению с ранним слиянием сигналов ядра и клетки. Он явно превосходит современную систему Mask R-CNN [4], применяемую для обнаружения и сегментации клеток, с улучшением относительной средней средней точности до 23,88% и 23,17% соответственно.

Наш подход связан с несколькими подходами к сегментации экземпляров для изображений флуоресцентной микроскопии.Методы, не основанные на глубоком обучении, такие как алгоритмы вырезания графов [5–9], обычно борются с морфологически сложными объектами. Точно так же другие методы либо рассматривают ядра [5, 10, 11], либо сегментируют объекты аналогичного размера и в основном круглые [12] или различной формы [13, 14]. В частности, все эти методы рассматривают только один сигнал, будь то клетка или ядро. Метод, использующий информацию ядра вместе с клеточным сигналом, описан Held et al. [15] и Wenzel et al. [16]. Их алгоритм сегментации использует набор быстроходных уровней [17], т.е.е., классический метод компьютерного зрения, не основанный на методах машинного обучения. Более поздний подход, предложенный Аль-Кофахи и др. [18] уточняет сегментацию ядра на основе глубокого обучения с помощью алгоритма засеянного водораздела для сегментации клеток.

Последние алгоритмы сегментации на основе CNN можно условно разделить на две группы. Алгоритмы первой группы выполняют полную сегментацию изображения и требуют дополнительной постобработки для применения к сегментации экземпляров [19–21]. Хорошо известным примером биомедицинской сегментации изображений является архитектура U-Net [22].Однако такие методы не работают в случае кластерных ячеек. Из-за небольшого количества неправильно классифицированных пикселей соседние ячейки объединяются в одну ячейку, что снижает производительность обнаружения.

По этой причине мы считаем методы второй группы алгоритмов сегментации на основе CNN более подходящими для наших данных. Эти методы выполняют обнаружение с последующей сегментацией, т. Е. Обнаруженные ограничивающие рамки сегментируются, а не все изображение. Например, ван Вален и др. [23] используют обнаружение объектов и на следующем этапе выполняют сегментацию ограничивающей рамки.Akram et al. [24] описывают архитектуру CNN с использованием объединения областей интересов (RoI) для обнаружения ячеек и сегментации на основе экземпляров. Недавно Mask R-CNN [4], основанная на Faster R-CNN [25] с пирамидами признаков [26], достигла самых современных результатов в обнаружении и сегментации объектов естественного изображения. Следовательно, наш подход к обнаружению и сегментации ядер и клеток основан на Mask R-CNN. Однако, в отличие от недавних работ по применению Mask R-CNN для решения ряда проблем сегментации в биомедицинской визуализации, включая сегментацию ядра [27–29], мы расширяем архитектуру для удовлетворения требований наборов данных, содержащих как сигналы клеток, так и ядра.

Дизайн и реализация

Изображения флуоресцентной микроскопии, используемые в нашей работе, собираются в рамках высокопроизводительного скрининга для выявления методов лечения, которые влияют на бактерию Legionella pneumophila и модифицируют инфекцию макрофагов человека. Микроскопические изображения не только позволяют оценить размножение бактерий, но также позволяют исследовать морфологические изменения.

Подготовка клеток и получение изображений

Моноцитарные клетки THP-1 получали из АТСС, инокулировали из культуры при -80 ° C и пассировали в среде RPMI-1640 с 10% фетальной телячьей сывороткой (Biochrom) при 37 ° C и 5% CO ₂ .Количество использованных пассажей клеток находилось в диапазоне от 5 до 14. Клетки высевали в 100 мкл мкл на 96-луночные планшеты Sensoplate Plus (Greiner Bio-One) в концентрации 1,45 × 10 ⁴ клеток на лунку. Дифференцировку макрофагов индуцировали через 24 часа после посева путем добавления 20 нМ форбол 12-миристат 13-ацетата (PMA; Sigma-Aldrich) на 24 часа. После обновления среды клетки инфицировали GFP-экспрессирующим Legionella pneumophila штамма Corby при множественности инфицирования 20 в течение 16 часов.Для заражения бактерии высевали на агар BCYE, инкубировали в течение 3 дней при 37 ° C и 5% CO ₂ , ресуспендировали и добавляли к макрофагам [30]. После заражения клетки промывали, фиксировали 4% параформальдегидом в течение 15 минут и повышали проницаемость с помощью 0,1% Triton X-100 в течение 10 минут. Окрашивание клеток достигали с помощью HCS CellMask Red (2 μ г / мл; Thermo Fisher Scientific) и Hoechst 33342 (2 μ г / мл; Invitrogen) в течение 30 мин.

Изображения были получены с помощью автоматического флуоресцентного микроскопа Nikon Eclipse Ti-E с объективом 20x (Nikon CFI Plan Apo VC 20X) и камеры Nikon Digital Sight DS-Qi1Mc.Наконец, изображения были преобразованы в формат TIFF с помощью плагина Fiji / ImageJ Bio-Formats.

Всего было собрано несколько сотен тысяч трехканальных изображений размером 1280 × 1024 пикселей.

Набор данных о клетках макрофагов

Для нашего эталонного набора данных было отобрано 82 репрезентативных изображения, дополненных достоверной информацией биомедицинским исследователем. В нашей работе интерес представляют только ядро ​​и клеточные каналы.

Эти 82 двухканальных изображения были случайным образом разделены на обучающий набор, содержащий 64 изображения, и тестовый набор, содержащий 18 изображений. В то время как обучающий набор содержит 2044 клетки и 2081 ядро, тестовый набор содержит 508 клеток и 514 ядер. Несоответствие между количеством экземпляров клеток и ядер связано с тем, что пограничные клетки не полностью видны на изображениях. Кроме того, некоторые клетки находятся в своей митотической фазе, то есть в одной клетке может встречаться несколько ядер.

Создание наземных меток для задач сегментации вручную занимает очень много времени. Поэтому мы сгенерировали основные маски сегментации для экземпляров клеток и ядер в двухэтапном процессе.На первом этапе были применены классические алгоритмы компьютерного зрения для создания начальной сегментации с использованием подхода на основе порогов и функций обработки контуров из библиотеки OpenCV [31] для поиска экземпляров клеток и ядер. Кроме того, структуры этих экземпляров были проанализированы, и клетки с более чем одним ядром были разделены аналогично сегментации Вороного, где каждый пиксель клетки привязан к ближайшему ядру. На втором этапе эти сегменты были уточнены вручную с помощью инструмента обработки изображений, разработанного для научных многомерных изображений, под названием Fiji / ImageJ [32].Большинство наших ручных исправлений были необходимы от ячейки до границ ячеек.

Чтобы сегментировать клетки макрофагов, мы следуем подходу сегментации на основе экземпляров, вводя новую архитектуру нейронной сети, основанную на Mask R-CNN. Он сочетает в себе особенности ядра и клетки в схеме слияния пирамиды. Архитектура Mask R-CNN [4] является расширением Faster R-CNN [25], которое предсказывает ограничивающие рамки с вероятностями классов и дополнительными масками сегментации на основе экземпляров.

Как и Faster R-CNN, Mask R-CNN является двухэтапным методом.На первом этапе сеть предложений регионов (RPN) используется для поиска предложений по объектам (интересующие регионы, RoI). Таким образом, прогнозируются ограничивающие рамки кандидатов вместе с оценками объектности. На втором этапе для этих возможных ограничивающих рамок извлекаются признаки с помощью слоя RoI Align, который вычисляет карты признаков фиксированного размера посредством билинейной интерполяции. На основе этих карт характеристик возможные ограничивающие рамки уточняются, классифицируются и сегментируются с использованием соответственно регрессии, классификации и сегментирования.Функции двух этапов являются общими в базовой архитектуре для улучшения времени выполнения. Архитектура магистрали CNN обычно предварительно обучается задаче классификации изображений. Общая нейронная сеть настраивается и обучается от начала до конца с использованием многозадачных потерь L = L _box + L _cls + L _маска , где L _{прямоугольник} — потери регрессии ограничивающего прямоугольника, L _cls — потери классификации, а L _маска — потеря маски (т.е.е., на пиксельный сигмоид с двоичными потерями) соответственно.

Для повышения производительности обнаружения и сегментации в областях малых объектов, Mask R-CNN использует сеть пирамид функций (FPN) [26], нисходящую архитектуру с боковыми подключениями к магистральным слоям для построения высокоуровневых семантических карт признаков на все весы. Карты функций для регрессии, классификации и сегментации ограничивающих прямоугольников-кандидатов извлекаются из уровня пирамиды в соответствии с размерами ограничивающего прямоугольника. Ограничительные рамки большего размера назначаются более высоким уровням пирамиды, а прямоугольники меньшего размера — более низким уровням, соответственно.На рис. 2 базовая архитектура Mask R-CNN выделена зеленым.

Рис. 2. Пирамида признаков слияния признаков ядра.

Предварительно обученные признаки ядра (фиолетовый) объединяются с признаками пирамиды признаков в модели обнаружения и сегментации клеток (зеленый) либо путем конкатенации, либо сложения.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1008179.g002

Остальная часть этого раздела организована следующим образом. Сначала мы опишем используемую магистральную CNN.Затем представлена ​​новая сетевая архитектура, использующая схему слияния пирамид для интеграции функций ядра для обнаружения и сегментации клеток.

Кроме того, вводится взвешенная потеря сегментации, чтобы сфокусировать процесс обучения на трудных для сегментации пикселях на границах ячеек. Наконец, мы описываем этапы постобработки для дальнейшего улучшения результатов обнаружения и сегментации.

Сокращенная магистраль ResNet-50

(ResNet) [33] обеспечивают высочайшую производительность в задачах классификации естественных изображений и обнаружения объектов.Из-за ограниченного числа классов объектов (например, клеток или ядер), пониженного фонового шума изображений флуоресцентной микроскопии по сравнению с естественными изображениями и требований времени выполнения, вызванных экспериментами с высокой пропускной способностью, сокращенный ResNet-50 используется в качестве магистральная архитектура для нашей сети сегментации. Чтобы ускорить обучение, количество фильтров, а также количество строительных блоков в архитектуре ResNet было уменьшено вдвое, что привело к примерно в десять раз меньшим параметрам по сравнению с исходным ResNet-50.В таблице 1 подробно показана сокращенная архитектура ResNet-50. Эта архитектура была обучена классификации изображений. Предварительно обученная сеть для изображений RGB здесь не подходит, так как входы — это одноканальные изображения для ядер и клеток соответственно. Таким образом, мы преобразовали набор данных ImageNet [34] в оттенки серого. Основываясь на 1-канальном наборе данных ImageNet, базовая модель была обучена для 120 эпох с использованием пакетной нормализации [35].

Слияние пирамид с элементами

На рис. 3 показаны архитектуры для сегментации клеток на основе экземпляров с использованием различных способов интеграции информации ядра.Архитектура на рис. 3а вообще не содержит никакой информации о ядре. По сути, это маска R-CNN, обученная на масках ячеек для обнаружения объектов одного класса. Подобно ранней схеме слияния, изображение ядра добавляется в качестве дополнительного канала к изображению клетки и подается непосредственно в Mask R-CNN (рис. 3b). Однако эта архитектура не может использовать доступную достоверную информацию для ядра канала во время процесса обучения.

обычно имеют схожую форму и размер, и в большинстве случаев они четко отделимы друг от друга по сравнению с внешним видом клеток макрофагов.Поэтому мы разработали нашу модель сегментации клеток в два этапа. На первом этапе мы обучаем модель для сегментации ядра, чтобы получить полезные функции ядра для задачи сегментации клетки (рис. 2, фиолетовый). Эта архитектура Mask R-CNN, использующая пирамиды функций на основе сокращенной магистрали ResNet-50, обучена для сегментации ядра.

На втором этапе изученные особенности FPN задачи сегментации ядра включаются в архитектуру сегментации клеток с использованием слияния пирамид признаков (FPF).На каждом уровне пирамиды функций мы получаем стек активаций, который объединяется в архитектуру сегментации ячеек в соответствующем масштабе. Это означает, что на каждом этапе пирамиды признаков доступны предварительно обученные признаки ядер клеток, которые можно использовать во время обучения в дополнение к картам признаков для сегментации клеток (рис. 2, зеленый цвет). За исключением пирамид слитых признаков, архитектура основы для сегментации клеток такая же, как у ResNet-50, что и для сегментации ядра.

Мы также оценили две операции слияния для остаточных и боковых соединений: конкатенацию и сложение.Параметры объединенного ядра фиксируются во время обучения сегментации клеток, что позволяет нам комбинировать обе модели во время вывода для одновременного прогнозирования масок сегментации ядра и клетки. Окончательная модель сегментации клеток имеет два входа: изображение ядра и изображение цитоплазмы. Архитектура модели была реализована в Tensorflow [36] и основана на реализации Mask R-CNN [37].

Взвешенная потеря сегментации

Поскольку сложнее сегментировать пиксели на границах ячеек, особенно в кластерах ячеек, мы применили схему взвешивания для потери маски, чтобы сфокусировать модель на краях ячеек.Взвешивание аналогично взвешиванию, используемому Ronneberger et al. [22]. Придавая больший вес краям, модель должна научиться более точно предсказывать контуры ячеек, что требует точных и последовательных масок сегментации. Мы вычислили гауссову размытую матрицу весов на основе контуров ячеек в маске сегментации полного изображения. Функция размытия по Гауссу для пикселей x , y определяется как с горизонтальным расстоянием x и вертикальным расстоянием y от начала координат.Мы использовали ядро ​​25 × 25 и стандартное отклонение σ = 5. Используя матрицу весов, пиксели около граничных пикселей взвешиваются до двух раз выше, чем обычные пиксели, то есть пиксели внутри ячеек. Рис. 4 (d) показывает визуализацию урожая из матрицы весов на основе контуров, вычисленных на рис. 4 (b). Обрезка соответствует маске экземпляра на рис. 4 (c). Он используется для взвешивания потерь маски для предложения коробки, обработанного в ветви маски.

Постобработка

Для дальнейшего повышения производительности обнаружения и сегментации ячеек выполняются следующие шаги постобработки.Во-первых, методы обработки контуров из библиотеки OpenCV используются для обнаружения областей ядра, которые перекрываются более чем одной клеткой. В этом случае объединяются соответствующие маски сегментации ячеек. Во-вторых, для поиска областей ячеек, не охваченных масками сегментации на основе экземпляров, применяется метод сегментации на основе пороговых значений из-за редко возникающих ложных срабатываний или смещенных ограничивающих рамок. Следовательно, прогнозируемые маски сегментации вычитаются из сегментации на основе пороговых значений, морфологические операции и обработка контуров применяются для обнаружения областей, а области, размер которых меньше предварительно определенного порогового значения, отбрасываются. Остальные регионы обрабатываются следующим образом:

• Область добавляется в ячейку, если она может быть подключена к соответствующему экземпляру ячейки.
• Регион отбрасывается, если он подключен к нескольким экземплярам ячеек.
• В противном случае создается новый экземпляр ячейки.

В-третьих, области ядра, которые не полностью покрыты областями клетки, используются либо для увеличения перекрывающейся области клетки, либо для создания новой клетки с той же формой, что и ядро.

Однако, чтобы обеспечить справедливое сравнение, в экспериментах не проводилась постобработка по сравнению с другими методами.

Результаты

В этом разделе исследуется производительность трех сетевых архитектур, показанных на рисунке 3. Мы дополнительно сравниваем производительность с производительностью U-Net, чтобы оценить, насколько хорошо работает сегментация без обнаружения (U-Net) по сравнению с обнаружением и сегментацией с архитектурами Mask R-CNN.Чтобы обучить архитектуру U-Net, мы настроили взвешивание промежутков между соседними ячейками (или ядрами, соответственно), чтобы добиться лучших результатов на соответствующих наборах данных, чем с настройками, использованными в исходной статье [22]. Другие параметры обучения, такие как скорость обучения и количество эпох, также были оптимизированы для достижения наилучших результатов. Поскольку модель U-Net не возвращает ограничивающие прямоугольники, контуры ячеек использовались для получения ограничивающих прямоугольников. В пользу U-Net контуры внутри контуров и очень маленькие ограничивающие рамки были проигнорированы в нашей оценке.Кроме того, мы сравниваем производительность со Stardist [12], который обеспечивает самые современные результаты сегментации ядра.

Сначала исследуется архитектура Mask R-CNN на рис. 3a. Без какой-либо информации о ядрах ожидается, что его производительность будет ниже, чем для других архитектур.

Во-вторых, чтобы убедиться, что включение информации ядра действительно полезно, Mask R-CNN расширяется, чтобы принять дополнительный входной канал (рис. 3b). Это простой способ включения информации ядра.Однако он не использует доступные маски сегментации наземной истинности для ядер.

В-третьих, оценивается предложенная архитектура слияния пирамиды признаков, показанная на рис. 3c, где признаки пирамиды предварительно обученной модели ядра объединяются с признаками клетки с использованием схемы слияния пирамиды. В рамках этой схемы слияния оцениваются две операции слияния: конкатенация и сложение. Недавняя работа по изучению архитектур CNN предполагает, что операции сложения во многих случаях более полезны, чем операции конкатенации [38].Кроме того, архитектуры слияния пирамид признаков оцениваются в сочетании с взвешенными потерями сегментации, описанными выше.

Уровни магистральной архитектуры были инициализированы предварительно обученными весами из задачи классификации изображений с использованием набора данных ImageNet. Во всех экспериментах для FPF использовались одни и те же предварительно натренированные веса. Для архитектуры на рис. 3b с двумя входными каналами предварительно обученные веса первого сверточного слоя были дублированы и уменьшены вдвое, чтобы не нарушать зависимости весов последующих слоев.

Во всех экспериментах с FPF применялся один и тот же график обучения со скоростью обучения 0,001, импульсом 0,9 и коэффициентом уменьшения веса 0,0001. График обучения следующий: помимо предварительно обученной сегментации магистрали, головы регрессии и классификации обучаются для 100 000 итераций. Затем все слои магистрали глубже conv4 обучаются еще на 250 000 итераций. Наконец, вся сеть обучается на 500 000 итераций со сниженной скоростью обучения 10 ^-4 .Потери регрессии и потери маски взвешиваются с коэффициентом 2.

Все модели сегментации, кроме конфигурации с двумя входными каналами, были обучены на одноканальных входных изображениях 512 × 512. В процессе обучения к обучающим изображениям применялось увеличение данных, что увеличивает количество обучающих изображений до 497, 355 размером 512 × 512 для каждого канала, содержащего 3, 557, 425 ядер в 4, 288, 104 ячейках. Варианты архитектуры FPF используют одну и ту же модель для функций ядра.Он был обучен с использованием того же ранее описанного расписания обучения для моделей сегментации клеток.

Все модели оценивались на тестовом наборе данных, описанном выше. Кроме того, чтобы убедиться, что FPF работает лучше, особенно для кластерных ячеек, мы создали подмножество тестового набора данных. Это подмножество содержит все кластеры ячеек, встречающиеся на тестовых изображениях, но не отдельные ячейки. Полученные 78 изображений имеют размер 256 × 256 пикселей. Каждое изображение содержит как минимум один кластер из двух или более ячеек.Всего набор данных содержит 255 ячеек с 258 ядрами.

Результаты обнаружения и сегментации

Во-первых, мы оценили производительность модели ядра, используемой в архитектурах FPF (как описано в таблице 1), Stardist и U-Net. В таблице 2 показаны результаты как для обнаружения, так и для сегментации с точки зрения AP на тестовых изображениях ядер. Результаты обнаружения и сегментации аналогичны, так как большинство ядер круглые и изолированные. Однако в некоторых случаях ядра оказываются смежными.Эти экземпляры трудно разделить для U-Net, который не может быть обучен обнаружению экземпляров перед сегментацией. Stardist работает немного лучше для сегментации, в то время как Mask-RCNN работает немного лучше для обнаружения.

Затем производительность архитектуры без какой-либо информации о ядре, архитектура с двумя входными каналами и архитектуры FPF оцениваются для обнаружения и сегментации ячеек. Далее ⊙ используется для объединения, а ⊕ — для сложения. Эксперименты проводятся на всем наборе тестовых данных ячеек, а также на подмножестве тестовых данных ячеек, которое содержит исключительно сгруппированные ячейки, чтобы более внимательно изучить те экземпляры, которые трудно обнаружить и сегментировать.

баллов AP для обнаружения и сегментации в наборе данных тестирования ячеек показаны в таблицах 3 и 4 соответственно. Как и ожидалось, эффективность сегментации клеток намного хуже, когда знания о ядрах вообще не учитываются. Просто добавив еще один входной канал для сигнала ядра в Mask R-CNN (см. Рис. 3b), можно достичь значительно лучших результатов. Для модели U-Net тот же метод используется для интеграции канала ядра, т.е. модель имеет два, а не один входной канал.У архитектуры U-Net для набора данных тестирования ячеек два недостатка. Во-первых, он не может использовать доступную наземную истинность ядер напрямую, а во-вторых, в этом наборе данных даже больше трудно разделимых сигналов, чем в наборе данных ядра. Поскольку Stardist обучен только сегментации клеток, он не может использовать информацию о ядрах. Однако Stardist по-прежнему работает хуже, чем модель Mask R-CNN без информации о ядре. По сравнению с показателями Stardist на тестовом наборе ядер, это, скорее всего, вызвано неправильной формой ячеек и сгруппированных ячеек.

FPF работает лучше, чем просто использование дополнительного входа для Mask R-CNN. Однако это не зависит от операции слияния: слияние функций путем конкатенации или добавления приводит к аналогичной производительности. Показатели AP для обнаружения (таблица 3) и сегментации (таблица 4) аналогичны для всех конфигураций слияния пирамид. Хотя средняя производительность AP немного лучше для обеих архитектур, обученных с учетом взвешенных потерь, более высокий вес краев на промежутках между ячейками и пикселями, близкими к границе, в функции потерь не приводит к значительному увеличению производительности ни при обнаружении, ни при сегментации. .По сравнению со средней AP модели без какой-либо информации о ядре, наиболее эффективная архитектура FPF (FPF ⊕ со взвешенными потерями) обеспечивает прирост производительности 10,25%. По сравнению с моделью с входным каналом ядра, относительный прирост производительности составляет 3,02%. Точно так же прирост производительности при обнаружении составляет 10,48% (без ядра) и 3,5% (входной канал ядра). Подробная оценка, включая количество истинных положительных (TP), ложноположительных (FP) и истинно отрицательных (FN) результатов сегментации для порога IoU, равного 0. 75 показано в Таблице 5.

Превосходная производительность архитектур FPF становится очевидной, когда они оцениваются на подмножестве сгруппированных ячеек (таблицы 6 и 7): относительное улучшение производительности на 23,88% (без ядра) и 4,43% (входной канал ядра) для обнаружения с точки зрения означает AP. На рис. 6 показаны результаты сегментации сгруппированных ячеек. На рис. 7 показана визуализация масок сегментации, предсказываемых моделью без информации о ядре, с каналом ядра и наиболее эффективной архитектурой FPF.

Рис 7. Визуализация сегментации сгруппированных ячеек.

Вверху: сигнал ядра (a), сигнал цитоплазмы (b) и базовая истинная сегментация (c). Внизу: сегменты экземпляров, предсказанные для модели без информации о ядре (d), с каналом ядра (e) и FPF ⊕ с взвешенными потерями (f).

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1008179.g007

Аналогично для сегментации FPF ⊕ с взвешенными потерями работает лучше. Относительное улучшение производительности — 23.17% по сравнению с моделью без информации о ядре и 4,16% по сравнению с моделью с входным каналом ядра, как с точки зрения среднего AP. На рис. 8 показан пример сегментации, выполняемой FPF ⊕ с взвешенными потерями на кластере макрофагов. Эксперименты показывают, что U-Net здесь не подходит, а архитектура FPF на основе экземпляров работает намного лучше. Хотя Stardist хорошо работает для сегментации ядра, производительность значительно ниже для сегментации клеток.

С помощью дополнительной постобработки среднее значение AP обнаружения в наборе данных сгруппированных ячеек улучшено до 0.65, а среднее значение AP сегментации увеличивается до 0,682. Для среднего AP обнаружения это относительное улучшение на 31,58% (без ядра) и на 10,92% (входной канал ядра). Для среднего значения AP сегментации это относительное улучшение на 24,45% (без ядра) и на 5,25% (входной канал ядра).

Время выполнения модели FPF составляет около 222 мс на изображение при использовании Tensorflow Serving на сервере с видеокартой Nvidia Geforce GTX 1080 Ti.

Доступность и будущие направления

В этой статье мы представили новый подход к глубокому обучению для обнаружения и сегментации клеток, основанный на слиянии ранее обученных функций ядра на разных уровнях пирамиды функций.Предлагаемая архитектура слияния пирамид функций явно превосходит современный подход Mask R-CNN для обнаружения и сегментации ячеек на нашем сложном наборе данных с кластеризацией ячеек с относительным повышением средней точности до 23,88% и 23,17% соответственно. В сочетании с этапом постобработки результаты могут быть дополнительно улучшены до 31,58% для обнаружения и 24,45% для сегментации соответственно.

Код, набор данных и модели общедоступны. Набор данных доступен по адресу https: // box.uni-marburg.de/index.php/s/N934NJi7IsvOphf. Код и модели доступны по адресу https://github.com/umr-ds/feature_pyramid_fusion.

Есть несколько направлений для будущей работы. Во-первых, может быть интересно совместное использование весов позвоночника для построения модели, которую можно обучить от начала до конца для обнаружения и сегментации ядра / клетки. С этой целью отдельные заголовки Mask R-CNN для ядер и клеток должны быть присоединены к архитектуре для генерации, регрессии, классификации и сегментации предложения области.Во-вторых, необходимо исследовать интеграцию потери сегментации всего изображения в дополнение к обнаружению и потере сегментации на основе экземпляров. В-третьих, оптимизация стратегий выборки якорных ящиков для ядер и клеток может привести к дальнейшему повышению производительности.

Ссылки

1. 1. Рейтер Дж. А., Спейсек Д. В., Снайдер М. П.. Технологии высокопроизводительного секвенирования. Молекулярная клетка. 2015. 58 (4): 586–597. pmid: 26000844
2. 2. Usaj MM, Styles EB, Verster AJ, Friesen H, Boone C, Andrews BJ.Высококачественный скрининг для количественной клеточной биологии. Тенденции в клеточной биологии. 2016; 26 (8): 598–611. pmid: 27118708
3. 3. Чен X, Чжу Y, Ли Ф, Чжэн З.Й., Чанг Э.С., Ма Дж. И др. Точная сегментация соприкасающихся клеток на изображениях многоканальной микроскопии с кластеризацией на основе геодезических расстояний. Нейрокомпьютеры. 2015; 149: 39–47.
4. 4. He K, Gkioxari G, Dollár P, Girshick R. Mask R-CNN. В: IEEE Int. Conf по компьютерному зрению (ICCV). IEEE; 2017. с. 2980–2988.
5. 5.Аль-Кофахи Ю., Лассуед В., Ли В., Ройзам Б. Улучшенное автоматическое обнаружение и сегментация ядер клеток на гистопатологических изображениях. IEEE Transactions по биомедицинской инженерии. 2010. 57 (4): 841–852. pmid: 19884070
6. 6. Abreu A, Frenois FX, Valitutti S, Brousset P, Denèfle P, Naegel B и др. Оптимальный разрез минимального остовного дерева для трехмерной сегментации ядер клеток. В: 10-е Междунар. Symp. по обработке и анализу изображений и сигналов. IEEE; 2017. с. 195–199.
7. 7.Димопулос С., Майер К.Э., Рудольф Ф., Стеллинг Дж. Точная сегментация клеток на микроскопических изображениях с использованием образцов мембран. Биоинформатика. 2014. 30 (18): 2644–2651. pmid: 24849580
8. 8. Кайседо Дж. К., Гудман А., Кархос К. В., Чимини Б. А., Акерман Дж., Хагиги М. и др. Сегментация ядра в экспериментах по визуализации: Data Science Bowl 2018. Методы природы. 2019; 16 (12): 1247–1253. pmid: 31636459
9. 9. Кайседо Дж. К., Рот Дж., Гудман А., Беккер Т., Кархос К. В., Бройсин М. и др.Оценка стратегий глубокого обучения для сегментации ядра на флуоресцентных изображениях. Цитометрия. Часть A. 2019; 95 (9): 952–965. pmid: 31313519
10. 10. Cheng J, Rajapakse JC и др. Сегментация кластерных ядер с маркерами формы и функцией маркировки. IEEE Trans по биомедицинской инженерии. 2009. 56 (3): 741–748. pmid: 19272880
11. 11. Гудла П.Р., Нанди К., Коллинз Дж., Миберн К., Мистели Т., Локетт С. Высокопроизводительная система для сегментации ядер с использованием многомасштабных методов. Цитометрия, часть A. 2008; 73 (5): 451–466. pmid: 18338778
12. 12. Шмидт У., Вейгерт М., Броддус Ч., Майерс Г. Обнаружение клеток с помощью выпуклых звездообразных многоугольников. Компьютерная обработка изображений и компьютерное вмешательство (MICCAI). 2018.
13. 13. Солис-Лемус Дж. А., Страмер Б., Слабо Дж., Рейес-Альдасоро СС. Сегментация и анализ формы макрофагов с помощью анализа угловой диаграммы. Журнал визуализации. 2017; 4 (1): 2.
14. 14. Амат Ф., Лемон В., Моссинг Д.П., Макдол К., Ван И, Брэнсон К. и др.Быстрая и точная реконструкция клеточных линий по данным крупномасштабной флуоресцентной микроскопии. Методы природы. 2014; 11 (9): 951. pmid: 25042785
15. 15. Held C, Wenzel J, Webel R, Marschall M, Lang R, Palmisano R и др. Использование мультимодальной информации для сегментации флуоресцентных микрофотографий с применением в вирусологии и микробиологии. В: IEEE Int. Конф. по инженерии в медицине и биологии. IEEE; 2011. с. 6487–6490.
16. 16. Венцель Дж., Хельд С., Палмизано Р., Тойфель С., Дэвид Дж. П., Виттенберг Т. и др.Измерение TLR-индуцированного распространения макрофагов с помощью автоматического анализа изображений: дифференциальная роль Myd88 и MAPK в ранних и поздних ответах. Границы физиологии. 2011; 2: 71. pmid: 22028692
17. 17. Сетиан Дж. А. Методы набора уровней и методы быстрого перехода: развивающиеся интерфейсы в вычислительной геометрии, механике жидкости, компьютерном зрении и материаловедении. т. 3. Издательство Кембриджского университета; 1999.
18. 18. Аль-Кофахи Ю., Зальцман А., Грейвс Р., Маршалл В., Русу М.Алгоритм на основе глубокого обучения для двумерной сегментации клеток на микроскопических изображениях. BMC Bioinformatics. 2018; 19 (1): 1–11. pmid: 30285608
19. 19. Лонг Дж., Шелхэмер Э., Даррелл Т. Полностью сверточные сети для семантической сегментации. В: IEEE Conf. по компьютерному зрению и распознаванию образов; 2015. стр. 3431–3440.
20. 20. Но Х, Хонг С., Хан Б. Изучение сети деконволюции для семантической сегментации. В: IEEE Int. Конф. по компьютерному зрению; 2015. стр. 1520–1528.
21. 21.Бадринараян В., Кендалл А., Чиполла Р. Сегнет: Архитектура глубокого сверточного кодера-декодера для сегментации изображений. IEEE Transactions по анализу шаблонов и машинному анализу. 2017; 39 (12): 2481–2495. pmid: 28060704
22. 22. Роннебергер О., Фишер П., Брокс Т. U-net: Сверточные сети для сегментации биомедицинских изображений. В: Int. Конф. по медицинской обработке изображений и компьютерному вмешательству. Springer; 2015. стр. 234–241.
23. 23. Ван Вален Д.А., Кудо Т., Лейн К.М., Маклин Д.Н., Квач Н.Т., ДеФелис М.М. и др.Глубокое обучение автоматизирует количественный анализ отдельных клеток в экспериментах по визуализации живых клеток. Вычислительная биология PLoS. 2016; 12 (11). pmid: 27814364
24. 24. Акрам С.У., Каннала Дж., Эклунд Л., Хейккиля Дж. Сеть предложений по сегментации клеток для анализа микроскопических изображений. В: Глубокое обучение и маркировка данных для медицинских приложений. Springer; 2016. с. 21–29.
25. 25. Рен С., Хе К., Гиршик Р., Сан Дж. Быстрее R-CNN: На пути к обнаружению объектов в реальном времени с помощью сетей предложения регионов.В: Достижения в системах обработки нейронной информации; 2015. стр. 91–99.
26. 26. Лин Т.Ю., Доллар П., Гиршик Р., Хе К., Харихаран Б., Белонжи С. Функциональные пирамидальные сети для обнаружения объектов. В: Конференция IEEE по компьютерному зрению и распознаванию образов. т. 1; 2017. с. 4.
27. 27. Sompawong N, Mopan J, Pooprasert P, Himakhun W., Suwannarurk K, Ngamvirojcharoen J, et al. Автоматизированный скрининг на рак шейки матки по мазку Папаниколау с использованием глубокого обучения. Материалы ежегодной международной конференции IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, EMBS. 2019; п. 7044–7048.
28. 28. Джонсон JW. Автоматическая сегментация ядра с помощью Mask-RCNN. В кн .: Научно-информационная конференция. Springer; 2019. стр. 399–407.
29. 29. Вуола А.О., Акрам С.У., Каннала Дж. Маск-RCNN и U-net ансамбли для сегментации ядер. В: 16-й Международный симпозиум IEEE по биомедицинской визуализации 2019 г. (ISBI 2019). IEEE; 2019. стр. 208–212.
30. 30. Юнг А.Л., Херкт С.Е., Шульц С., Болте К., Зайдель К., Шеллер Н. и др. Инфекция Legionella pneumophila по-разному активирует клетки-свидетели посредством везикул бактерий и клеток-хозяев.Научные отчеты. 2017; 7 (1): 6301. pmid: 28740179
31. 31. Брадски Г. Библиотека OpenCV. Журнал программных средств доктора Добба. 2000.
32. 32. Schindelin J, Arganda-Carreras I, Frize E, Kaynig V, Longair M, Pietzsch T. и др. Фиджи: платформа с открытым исходным кодом для анализа биологических изображений. Природные методы. 2012. 9 (7): 676–682. pmid: 22743772
33. 33. He K, Zhang X, Ren S, Sun J. Глубокое остаточное обучение для распознавания изображений. В: IEEE Conf.по компьютерному зрению и распознаванию образов; 2016. с. 770–778.
34. 34. Дэн Дж., Донг В., Сочер Р., Ли Л. Дж., Ли К., Фей-Фей Л. Imagenet: крупномасштабная иерархическая база данных изображений. В: Конференция IEEE по компьютерному зрению и распознаванию образов. IEEE; 2009. с. 248–255.
35. 35. Иоффе С., Сегеди С. Пакетная нормализация: ускорение глубокого обучения сети за счет уменьшения внутреннего ковариантного сдвига. В: Int. Конф. по машинному обучению; 2015. стр. 448–456.
36. 36. Абади М., Бархам П., Чен Дж., Чен З., Дэвис А., Дин Дж. И др.TensorFlow: система для крупномасштабного машинного обучения. В: Симпозиум USENIX по разработке и внедрению операционных систем. т. 16; 2016. с. 265–283.
37. 37. Абдулла В. Маска R-CNN для обнаружения объектов и сегментации экземпляров на Keras и TensorFlow; 2017. https://github.com/matterport/Mask_RCNN.
38. 38. Лю Ч., Зоф Б., Шленс Дж., Хуа В., Ли Л.Дж., Фей-Фей Л. и др. Прогрессивный поиск нейронной архитектуры. В: Европейская конференция по компьютерному зрению; 2018.
39. 39.Lin TY, Maire M, Belongie S, Hays J, Perona P, Ramanan D и др. Microsoft COCO: общие объекты в контексте. В: Европейская конференция по компьютерному зрению. Springer; 2014. с. 740–755.
40. 40. Эверингем М., Ван Гул Л., Уильямс К. К., Винн Дж., Зиссерман А. Задача классов визуальных объектов паскаля (вокал). Международный журнал компьютерного зрения. 2010. 88 (2): 303–338.

Создание сложных моделей органоидов человека, включая сосудистые сети, путем включения мезодермальных клеток-предшественников

Культура клеток

Были использованы две независимые линии мужских ИПСК, полученных из крайней плоти человека (ИПСК STEMCCA NHDF и ИПСК NHDF Сендая).iPS-клетки были получены из коммерчески доступных нормальных дермальных фибробластов человека (ювенильный NHDF, C-12300, Promocell, Гейдельберг, Германия) путем перепрограммирования с использованием конструкции hSTEMCCA-lentiviral ⁴⁸ или набора для репрограммирования вируса Сендай (Cyto Tune 2.0 Sendai reprogramming векторы, Ref # A16517; Lot # A16517, Invitrogen, Carlsbad, CA). Клеточная линия STEMCCA NHDF iPS была любезно предоставлена ​​доктором Франком Эденхофером из Университета Инсбрука и уже была опубликована до ⁴⁹ .Основная характеристика клеточной линии Sendai NHDF iPS показана на рис. S2. iPS-клетки культивировали на культуральных чашках, покрытых матригелем, в среде StemMACS iPS-Brew (Myltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Германия). Для индукции MPC 5 × 10 ⁴ ИПСК на см ² высевали на чашки, покрытые матригелем, и культивировали в течение 1 дня в среде StemMACS iPS-Brew с 10 мкМ ингибитора ROCK (Y-27632). Впоследствии среду заменили на среду для мезодермальной индукции (Advanced DMEM / F12, 0,2 мМ L-глутамат, 60 мкг / мкл Vit. C, 10 мкМ CHIR 99021, 25 нг / мл BMP4) и клетки культивировали в течение 72 часов. Среду меняли каждый день. Для индукции эндотелиальных (EC) или гладкомышечных клеток (SMC) среду для дифференцировки меняли на среду для индукции EC (StemSpan SFEM, 200 нг / мл VEGF, 0,2 мМ форсколин) или среду для индукции SMC (Advanced DMEM / F12, 0,2 мМ L- Глутамат, 60 мкг / мл витамина C, 10 нг / мл PDGF-BB, 2 нг / мл активина A). Через 2 дня были обнаружены эндотелиальные клетки. Клетки гладкой мускулатуры были обнаружены на 4 день.

Метод для васкуляризированных органоидов опухоли был разработан на основе протокола наложения жидкости ^50,51 : Готовили суспензию отдельных клеток MPC.2 × 10 ³ MPC были смешаны в соотношении 1: 1 с GFP-меченными клетками MDA-MB-435s (рис. S1 A). Суспензию клеток переносили в покрытую агарозой лунку 96-луночного планшета. Для приготовления лунок, покрытых агарозой, 1% агарозу кипятят в воде и 50 мкл жидкого геля вносят в каждую лунку 96-луночного планшета. Агрегаты культивировали в течение 24 ч в увлажненном инкубаторе с 20% O ₂ (5% CO ₂ ) в среде опухолевых органоидов (Advanced DMEM / F12, 0,2 мМ L-глутамат, 60 мкг / мкл Vit.C, 10% FCS, 100 нг / мл VEGF, 1% пенициллин / стрептомицин, 10 мкМ ROCK-ингибитор (Y-27632)). После этого клетки помещали на 3 дня в инкубатор с 2% O ₂ (5% CO ₂ ). Агрегаты выращивали до 10 дней.

Для создания васкуляризированных нервных органоидов нервные и мезодермальные агрегаты готовили отдельно, а затем вносили в совместное культивирование. Сначала 7 × 10 ⁵ ИПСК высевали на лунку неадгезивного 6-луночного планшета (Nuclon Sphera, Thermo Scientific) и выращивали в течение ночи в 3D-суспензионной культуре.Для нейрональной индукции агрегаты выращивали в течение 2 дней в среде для нейронной индукции 1 (DMEM / F12 / Neurobasal (50:50), 1x добавка N2, 1x B27 (без витамина A), 1% L-глутамат, 10 мкМ SB431542 , 1 мкМ дорсоморфина, 3 мкМ CHIR 99210, 0,5 мкМ пурморфамина), а затем в течение 3 дней в среде нейрональной индукции 2 (DMEM / F12 / Neurobasal (50:50), 1x добавка N2, 1x B27 (без витамина A), 1% L-глутамат, 3 мкМ CHIR 99210, 0,5 мкМ пурморфамин). Начиная с 5-го дня агрегаты выращивали в среде нейральной дифференцировки (DMEM / F12 / Neurobasal (50:50), 1x добавка N2, 1x B27 (без витамина A), 1% L-глутамат, 60 мкг / мкл Vit.C). Для мезодермальной индукции агрегаты ИПСК культивировали в течение 3 дней в среде для мезодермальной индукции.

На 4-й день мезодермальной индукции и 5-й день нейральной индукции агрегаты культивировали совместно в среде нейральной дифференцировки в течение до 280 дней на качалке в увлажненном инкубаторе (20% O ₂ , 5% CO ₂ ).

Иммунофлуоресцентный анализ

Для иммунофлуоресцентного анализа васкуляризированные органоиды фиксировали в 4% растворе PFA в течение 30 минут, промывали PBS и заключали в агарозный гель (1%).После этого были приготовлены парафиновые срезы 5 мкм. Срезы депарафинизировали, регидратировали и окрашивали эозином и гематоксилином. Для иммунофлуоресцентного анализа антигены демонтировали с использованием буфера цитрата натрия (10 мМ, pH 6). Первичные антитела к TUJ1 (Biozol, 801202), GFAP (DAKO, Z0334), CD31 (DAKO, M0823), Iba1 (WAKO, 019-19741), Sox1 (R&D Systems, AF3369), Pax6 (Biolegend, 1), Brachyury ( T) (R&D Systems, AF2085), MAP2 (Abcam, AB32454), N-кадгерин (Sigma-Aldrich, C3865) и NG2 (Merck-Millipore, AB5320).Срезы инкубировали с первичными антителами в течение ночи при 4 ° C. Вторичные Cy2-, Cy3- или Cy5-меченные антитела использовали для визуализации первичных антител. Срезы инкубировали со вторичными антителами в течение 2 ч при комнатной температуре. Все антитела разводили в блокирующем растворе.

Анализы очистки тканей

Органоиды собирали, промывали в PBS и фиксировали в 4% PFA в PBS в течение 1 часа при комнатной температуре. После этого органоиды промывали 3 раза по 30 мин в PBS. Затем органоиды инкубировали в восходящей серии MeOH (30 минут 50% MeOH в PBS, 30 минут 80% MeOH в PBS, 2 × 30 минут 100% MeOH).Образцы промывали 2 раза по 30 мин в 20% ДМСО в МеОН. Затем образцы инкубировали в нисходящей серии MeOH (30 минут 80% MeOH в PBS, 30 минут 50% MeOH в PBS, 30 минут PBS) и инкубировали 2 × 30 минут в 0,2% Triton-X-100 в PBS. Затем образцы инкубировали в буфере для проникновения (PBS, 0,2% Triton X-100, 0,3 M глицин, 20% DMSO) при 37 ° C в течение ночи. Затем образцы инкубировали в блокирующем растворе (PBS, 0,2% Triton X-100, 0,3 M глицин, 6% BSA, 10% DMSO) в течение 16 часов при 37 ° C. Затем образцы промывали 2 раза по 1 ч в промывочном буфере (0.2% Tween-20 в PBS), а затем инкубировали с первичными антителами в буфере для антител (PBS, 20% Tween-20, 4% BSA, 5% DMSO) в течение 24 часов при 37 ° C. Были использованы следующие первичные антитела: GFAP (DAKO, Z0334), CD31 (DAKO, M0823), Iba1 (WAKO 019-19741) и Pax6 (Biolegend, 1). Следующие образцы дважды промывали по 30 мин в промывочном буфере. Инкубацию со вторичными антителами проводили в течение ночи при 37 ° C в буфере для антител. Образцы промывали 3 раза по 30 мин в промывочном буфере, 3 раза по 30 мин в 50% МеОН в PBS, 3 раза по 30 мин в 80% МеОН в PBS и 3 раза по 30 мин в 100% МеОН.Наконец, образцы инкубировали в этилциннамате в течение 24 ч при 37 ° C.

Иммуноблот-анализы

Для иммуноблот-анализов клетки лизировали буфером RIPA (150 мМ NaCl, 1% Тритон X, 0,5% дезоксихолат натрия, 0,1% SDS, 50 мМ Трис (pH 8,0)). Белки разделяли электрофорезом в SDS-полиакриламидном геле и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану блокировали с использованием 5% сухого молока в промывочном буфере (8,5 мМ Tris-HCl, 1,7 мМ Tris-Base, 50 мМ NaCl, 0,1% Tween 20 в a. Bidest) в течение 1 ч и инкубировали с первичными антителами против Brachyury (T ) (R&D Systems, AF2085) и β-актин (Sigma Aldrich, A1978) в течение 2 часов при комнатной температуре.Вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена, использовали для обнаружения первичных антител. Антитела разводили в блокирующем растворе. Для визуализации связанных антител использовали раствор люминола.

Проточные цитометрические анализы

Проточные цитометрические анализы выполняли с использованием FACSCanto II и полученные данные анализировали с помощью программного обеспечения FACSDiva (версия 6. 1.3) (BD Biosciences, США). Чтобы отличить жизнеспособные клетки от апоптоза, добавляли 1 мкл фиксируемого красителя жизнеспособности 450 (BD Biosciences, Калифорния, США) и инкубировали в течение 15 мин.После этого клетки фиксировали 4% PFA в PBS, дважды промывали PBS и, наконец, инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре в блокирующем буфере (5% BSA в PBS). Клетки пермеабилизировали с использованием блокирующего буфера, содержащего 0,1% Тритон Х-100. После этого клетки инкубировали с первичными антителами против Brachyury (T) в течение 1 ч при комнатной температуре. Антитела разводили в блокирующем буфере. После 3 промывок PBS клетки инкубировали с соответствующими вторичными антителами против IgG в PBS при комнатной температуре в течение 45 мин. Неокрашенные клетки и клетки, обработанные только вторичными антителами, служили отрицательными контролями.

Трансплантация на куриный CAM

10-20 опухолевых органоидов переносили в 10 мкл матригеля и помещали на нейлоновую сетку 1,5 × 1,5 см (размер сетки 150 мкм, открытая поверхность 50%, диаметр струны 62 мкм, 35 ​​г / м ² , PAS2, Хартенштайн, Германия). После гелеобразования сетку помещали вверх дном на САМ развивающегося куриного эмбриона на 7 день развития. Через 3 дня сетку вырезали из САМ, промывали PBS и фиксировали в течение 1 часа в 4% PFA. Затем были приготовлены парафиновые срезы 5 мкм и обработаны для иммунофлуоресцентного анализа, как описано выше.Все процедуры соответствовали правилам, регулирующим эксперименты на животных в ЕС (ДИРЕКТИВА Совета европейских сообществ 2010/63 / EU). Они были проведены в соответствии с рекомендациями по уходу и использованию животных Вюрцбургского университета. In ovo эксперименты не требуют каких-либо специальных дополнительных припасов, если эмбрионы умерщвляются перед вылуплением, как это сделано в данном исследовании.

Просвечивающая электронная микроскопия

Органоиды фиксировали в 2,5% глутаральдегиде, 4% PFA в 0,1 М какодилатном буфере (50 мМ какодилат, 50 мМ KCl, 2. 5 мМ MgCl2, pH 7,2) на льду в течение 2 ч и промывали 4 раза 0,1 М какодилатным буфером, по 5 мин каждый. Затем органоиды фиксировали в течение 60 минут 1% тетроксидом осмия в 0,1 М какодилатном буфере и промывали 2 раза 0,1 М какодилатным буфером, по 10 минут каждый. После промывки водным бидестом органоиды дегидратировали в восходящем ряду EtOH с использованием растворов 30%, 50%, 70% EtOH, по 10 мин каждый. Органоиды контрастировали с 2% уранилацетатом в 70% EtOH в течение 60 минут и затем дегидратировали с использованием массива EtOH из 70%, 80%, 90%, 96% и два раза по 100% в течение 10 минут каждый.Затем органоиды инкубировали в пропиленоксиде (ПО) два раза по 30 мин перед инкубацией в смеси ПО и Epon812 (1: 1) в течение ночи. На следующий день образцы инкубировали в чистом Epon в течение 2 часов и заливали полимеризацией Epon при 60 ° C в течение 48 часов.

Образцы вырезали ультразвуком, собирали на никелевые сетки и затем окрашивали 2,5% уранилацетатом и 0,2% цитратом свинца и, наконец, анализировали с помощью просвечивающего электронного микроскопа LEO AB 912 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Германия).

сложная биология, питающая пандемию коронавируса

В 1912 году немецкие ветеринары ломали голову над случаем лихорадки кошки с чрезвычайно раздутым животом. Теперь это считается первым зарегистрированным примером ослабляющей силы коронавируса. В то время ветеринары этого не знали, но коронавирусы также вызывают бронхит у кур, а у свиней — кишечное заболевание, от которого погибает почти каждый поросенок в возрасте до двух недель.

Связь между этими патогенами оставалась скрытой до 1960-х годов, когда исследователи в Соединенном Королевстве и США выделили два вируса с короноподобными структурами, вызывающими простуду у людей. Ученые вскоре заметили, что вирусы, обнаруженные у больных животных, имеют такую ​​же щетинистую структуру, усеянную остроконечными выступами белка. Под электронным микроскопом эти вирусы напоминали солнечную корону, что побудило исследователей в 1968 году ввести термин коронавирусы для всей группы.

Это была семья динамичных убийц: собачьи коронавирусы могли нанести вред кошкам, кошачий коронавирус мог разрушить кишечник свиней. Исследователи считали, что коронавирусы вызывают у людей лишь легкие симптомы, пока вспышка тяжелого острого респираторного синдрома (SARS) в 2003 году не показала, насколько легко эти универсальные вирусы могут убивать людей.

Теперь, когда число погибших в результате пандемических всплесков COVID-19 растет, исследователи изо всех сил пытаются раскрыть как можно больше о биологии последнего коронавируса, получившего название SARS-CoV-2.Профиль убийцы уже появляется. Ученые узнают, что вирус развил множество адаптаций, которые сделали его гораздо более смертоносным, чем другие коронавирусы, с которыми человечество сталкивалось до сих пор. В отличие от близких родственников, SARS-CoV-2 может легко атаковать человеческие клетки в нескольких точках, причем основными целями являются легкие и горло. Попадая в организм, вирус использует разнообразный арсенал опасных молекул. И генетические данные свидетельствуют о том, что он скрывался в природе, возможно, десятилетиями.

Но об этом вирусе много неизвестно, в том числе о том, как именно он убивает, превратится ли он во что-то более или менее смертоносное и что он может рассказать о следующей вспышке из семейства коронавирусов.

«Их будет больше, либо уже, либо в процессе разработки», — говорит Эндрю Рамбо, изучающий вирусную эволюцию в Эдинбургском университете, Великобритания.

Среди вирусов, атакующих людей, большие коронавирусы.Имея 125 нанометров в диаметре, они также относительно велики для вирусов, которые используют РНК для репликации, группы, на долю которой приходится большинство вновь возникающих заболеваний. Но коронавирусы действительно выделяются своим геномом. Имея 30 000 генетических баз, коронавирусы имеют самые большие геномы среди всех РНК-вирусов. Их геномы более чем в три раза больше, чем геномы ВИЧ и гепатита С, и более чем в два раза больше геномов гриппа.

Коронавирусы также являются одними из немногих РНК-вирусов с механизмом проверки генома, который не позволяет вирусу накапливать мутации, которые могут его ослабить.Эта способность может быть причиной того, что обычные противовирусные препараты, такие как рибавирин, которые могут бороться с вирусами, такими как гепатит С, не смогли победить SARS-CoV-2. Лекарства ослабляют вирусы, вызывая мутации. Но в случае с коронавирусами корректор может отсеять эти изменения.

Мутации могут иметь свои преимущества для вирусов. Грипп мутирует в три раза чаще, чем коронавирусы, и это позволяет ему быстро развиваться и обходить вакцины. Но у коронавирусов есть особый трюк, который придает им смертельный динамизм: они часто рекомбинируют, обменивая фрагменты своей РНК с другими коронавирусами.Обычно это бессмысленная торговля одинаковыми частями между похожими вирусами. Но когда два дальних родственника коронавируса оказываются в одной и той же клетке, рекомбинация может привести к появлению грозных версий, которые заражают новые типы клеток и переходят к другим видам, говорит Рамбау.

Рекомбинация часто происходит у летучих мышей, которые являются переносчиками 61 вируса, который, как известно, заражает людей; некоторые виды содержат до 12 ¹ . В большинстве случаев вирусы не вредят летучим мышам, и существует несколько теорий о том, почему иммунная система летучих мышей может справиться с этими захватчиками.В статье, опубликованной в феврале, утверждается, что клетки летучих мышей, инфицированные вирусами, быстро излучают сигнал, который позволяет им принимать вирус, не убивая его. ² .

Оценки рождения первого коронавируса сильно различаются: от 10 000 до 300 миллионов лет назад. Ученым теперь известны десятки штаммов ³ , семь из которых инфицируют людей. Из четырех, вызывающих простуду, два (OC43 и HKU1) были получены от грызунов, а два других (229E и NL63) — от летучих мышей.Три вызывающих тяжелое заболевание — SARS-CoV (причина SARS), ближневосточный респираторный синдром MERS-CoV и SARS-CoV-2 — все произошли от летучих мышей. Но ученые считают, что обычно существует посредник — животное, зараженное летучими мышами, которое переносит вирус в человека. Считается, что в случае SARS посредником являются циветты, которые продаются на рынках живых животных в Китае.

Происхождение SARS-CoV-2 все еще остается открытым вопросом (см. «Семья убийц»). Этот вирус на 96% имеет общий генетический материал с вирусом, обнаруженным у летучей мыши в пещере в Юньнани, Китай. ⁴ — убедительный аргумент в пользу того, что он пришел от летучих мышей, говорят исследователи.Но есть принципиальная разница. Спайковые белки коронавирусов имеют единицу, называемую рецептор-связывающим доменом, которая играет центральную роль в их успешном проникновении в клетки человека. Связывающий домен SARS-CoV-2 особенно эффективен и во многом отличается от такового вируса летучих мышей Юньнани, который, по-видимому, не заражает людей ⁵ .

Что еще более усложняет ситуацию, чешуйчатый муравьед по имени панголин обнаружил коронавирус с рецептор-связывающим доменом, почти идентичным человеческой версии.Но остальная часть коронавируса была генетически похожа только на 90%, поэтому некоторые исследователи подозревают, что панголин не был посредником ⁵ . Тот факт, что действуют и мутации, и рекомбинации, усложняет попытки составить генеалогическое древо.

Но исследования, опубликованные за последние несколько месяцев и еще не прошедшие экспертную оценку, предполагают, что SARS-CoV-2 — или очень похожий предок — скрывался у некоторых животных в течение десятилетий. Согласно статье, опубликованной в сети за март ⁶ , линия коронавируса, ведущая к SARS-CoV-2, отделилась более 140 лет назад от тесно связанной линии, наблюдаемой сегодня у ящеров.Затем, где-то за последние 40–70 лет, предки SARS-CoV-2 отделились от версии летучей мыши, которая впоследствии потеряла эффективный рецептор-связывающий домен, который присутствовал у его предков (и остается в SARS-CoV-2). Исследование, опубликованное 21 апреля, дало очень похожие результаты с использованием другого метода датирования ⁷ .

Эти результаты предполагают долгую семейную историю с множеством ветвей коронавируса у летучих мышей и, возможно, панголинами, несущими тот же смертоносный рецептор-связывающий домен, что и SARS-CoV-2, в том числе некоторые из них, которые могут обладать аналогичной способностью вызывать пандемию, — говорит Расмус Нильсен. биолог-эволюционист Калифорнийского университета в Беркли и соавтор второго исследования.«Существует необходимость в постоянном наблюдении и повышении бдительности в отношении появления новых вирусных штаммов путем передачи зоонозов», — говорит он.

Две открытые двери

Хотя известные коронавирусы человека могут инфицировать многие типы клеток, все они в основном вызывают респираторные инфекции. Разница в том, что четыре, вызывающие простуду, легко поражают верхние дыхательные пути, тогда как MERS-CoV и SARS-CoV труднее закрепиться там, но более успешно заражают клетки в легких.

SARS-CoV-2, к сожалению, может сделать и то, и другое очень эффективно. Это дает ему два места для опоры, — говорит Шу-Юань Сяо, патолог из Чикагского университета, штат Иллинойс. Кашля соседа, который посылает вам десять вирусных частиц, может быть достаточно, чтобы вызвать инфекцию в вашем горле, но найденные там волосовидные реснички, скорее всего, сделают свое дело и избавятся от захватчиков. «Если сосед окажется ближе и закашлит 100 частиц в вашу сторону, вирус может попасть в легкие», — говорит Сяо.

Эти разные способности могут объяснить, почему у людей с COVID-19 такой разный опыт. Вирус может начаться в горле или носу, вызвать кашель и нарушить вкус и запах, а затем на этом закончиться. Или он может попасть в легкие и ослабить этот орган. Как он попадает туда, перемещается ли он клетка за клеткой или каким-то образом вымывается, неизвестно, говорит Стэнли Перлман, иммунолог из Университета Айовы в Айова-Сити, изучающий коронавирусы.

Клеменс-Мартин Вендтнер, врач-инфекционист из мюнхенской клиники Швабинг в Германии, говорит, что это может быть проблема с иммунной системой, которая позволяет вирусу проникать в легкие. Большинство инфицированных людей вырабатывают нейтрализующие антитела, адаптированные иммунной системой для связывания с вирусом и блокирования его проникновения в клетку. Но некоторые люди, кажется, не могут их сделать, — говорит Вендтнер. Возможно, поэтому некоторые выздоравливают после недели легких симптомов, в то время как другие страдают поздним началом болезни легких. Но вирус также может обходить клетки горла и попадать прямо в легкие. Тогда пациенты могут заболеть пневмонией без обычных легких симптомов, таких как кашель или субфебрильная температура, которые в противном случае были бы первыми, говорит Вендтнер.Наличие этих двух точек заражения означает, что SARS-CoV-2 может смешивать передаваемость коронавирусов простуды со летальностью MERS-CoV и SARS-CoV. «Это неудачная и опасная комбинация этого штамма коронавируса», — говорит он.

Способность вируса инфицировать и активно размножаться в верхних дыхательных путях стала неожиданностью, учитывая, что его близкий генетический родственник, SARS-CoV, не обладает такой способностью. В прошлом месяце Вендтнер опубликовал результаты ⁸ экспериментов, в которых его команде удалось культивировать вирус из горла девяти человек с COVID-19, показав, что вирус активно размножается и заразен там.Этим объясняется принципиальная разница между близкими родственниками. SARS-CoV-2 может выделять вирусные частицы из горла в слюну еще до появления симптомов, а затем они могут легко передаваться от человека к человеку. SARS-CoV был гораздо менее эффективен при совершении этого прыжка, проходя только тогда, когда симптомы проявлялись полностью, что облегчало его сдерживание.

Эти различия привели к некоторой путанице в отношении летальности SARS-CoV-2. Некоторые эксперты и СМИ описывают его как менее смертоносный, чем SARS-CoV, поскольку он убивает около 1% зараженных людей, тогда как SARS-CoV убивает примерно в десять раз больше.Но Перлман говорит, что это неправильный взгляд на это. SARS-CoV-2 намного лучше заражает людей, но многие инфекции не передаются в легкие. «Когда он попадает в легкие, он, вероятно, так же смертельно опасен», — говорит он.

То, что он делает, когда попадает в легкие, в некоторых отношениях похоже на то, что делают респираторные вирусы, хотя многое остается неизвестным. Подобно SARS-CoV и гриппу, он поражает и разрушает альвеолы, крошечные мешочки в легких, которые переносят кислород в кровоток.Когда клеточный барьер, отделяющий эти мешочки от кровеносных сосудов, разрушается, жидкость из сосудов просачивается внутрь, блокируя попадание кислорода в кровь. Другие клетки, в том числе лейкоциты, еще больше закупоривают дыхательные пути. Устойчивый иммунный ответ устранит все это у некоторых пациентов, но чрезмерная реакция иммунной системы может усугубить повреждение тканей. По словам Сяо, если воспаление и повреждение тканей будут слишком серьезными, легкие никогда не восстановятся, и человек умрет или останется с рубцами на легких.«С патологической точки зрения мы не видим здесь особой уникальности».

Как и в случае с SARS-CoV, MERS-CoV и коронавирусами животных, повреждение не прекращается на легких. Инфекция SARS-CoV-2 может вызвать чрезмерный иммунный ответ, известный как цитокиновый шторм, который может привести к полиорганной недостаточности и смерти. Вирус также может инфицировать кишечник, сердце, кровь, сперму (как и БВРС-КоВ), глаза и, возможно, мозг. Повреждение почек, печени и селезенки, наблюдаемое у людей с COVID-19, предполагает, что вирус может переноситься в крови и инфицировать различные органы или ткани, — говорит Гуань Вэй-цзе, пульмонолог из Института респираторного здоровья Гуанчжоу Медицинского центра Гуанчжоу. Университет, Китай, учреждение, получившее признание за свою роль в борьбе с атипичной пневмонией и COVID-19.По словам Гуана, вирус может инфицировать различные органы или ткани, где бы они ни находились.

Но хотя генетический материал вируса обнаруживается в этих различных тканях, еще не ясно, нанесен ли ущерб вирусом или цитокиновым штормом, говорит Вендтнер. «В нашем центре проходят вскрытия. Скоро появятся новые данные », — говорит он.

Заражает ли он горло или легкие, SARS-Cov-2 пробивает защитную мембрану клеток-хозяев, используя свои шипованные белки (см. «Смертельный захватчик»).Во-первых, рецептор-связывающий домен белка прикрепляется к рецептору, называемому ACE2, который находится на поверхности клетки-хозяина. ACE2 экспрессируется по всему телу на слизистой оболочке артерий и вен, которые проходят через все органы, но особенно плотно он экспрессируется в клетках, выстилающих альвеолы ​​и тонкий кишечник.

Хотя точные механизмы остаются неизвестными, данные свидетельствуют о том, что после того, как вирус прикрепляется, клетка-хозяин отрезает спайковый белок на одном из своих специализированных «сайтов расщепления», обнажая слитые пептиды — небольшие цепочки аминокислот, которые помогают вскрыть хозяина. клеточная мембрана, чтобы мембрана вируса могла слиться с ней.Как только генетический материал захватчика попадает внутрь клетки, вирус подчиняет себе молекулярный аппарат хозяина, чтобы произвести новые вирусные частицы. Затем это потомство покидает клетку, чтобы заразить других.

Скачки мощности

SARS-CoV-2 уникально оборудован для принудительного проникновения в клетки. И SARS-CoV, и SARS-CoV-2 связываются с ACE2, но рецептор-связывающий домен SARS-CoV-2 подходит особенно хорошо. Вероятность связывания ACE2 в 10–20 раз выше, чем у SARS-CoV ⁹ . Вендтнер говорит, что SARS-CoV-2 настолько хорош в заражении верхних дыхательных путей, что может даже существовать второй рецептор, который вирус может использовать для атаки.

Еще более тревожным является тот факт, что SARS-COV-2, по-видимому, использует фермент фурин от хозяина для расщепления вирусного шипового белка. По словам исследователей, это вызывает беспокойство, потому что фурин в изобилии присутствует в дыхательных путях и встречается по всему телу. Он используется другими грозными вирусами, включая ВИЧ, грипп, лихорадку денге и лихорадку Эбола, для проникновения в клетки. Напротив, молекулы расщепления, используемые SARS-CoV, гораздо менее распространены и не так эффективны.

Ученые считают, что участие фурина может объяснить, почему SARS-CoV-2 так хорош в прыжках от клетки к клетке, от человека к человеку и, возможно, от животного к человеку.Роберт Гарри, вирусолог из Тулейнского университета в Новом Орлеане, штат Луизиана, считает, что это дает SARS-CoV-2 в 100–1000 раз больше шансов проникнуть глубоко в легкие, чем SARS-CoV. «Когда я увидел, что у SARS-CoV-2 есть этот участок расщепления, я не очень хорошо спал в ту ночь», — говорит он.

Загадка заключается в том, откуда взялись генетические инструкции для этого конкретного сайта расщепления. Хотя вирус, вероятно, получил их в результате рекомбинации, эта конкретная установка никогда не была обнаружена ни в одном другом коронавирусе ни у одного вида.Уточнение его происхождения может быть последней частью головоломки, которая определит, какое животное было ступенькой, которая позволила вирусу достичь людей.

Конец игры

Некоторые исследователи надеются, что вирус со временем ослабнет в результате серии мутаций, которые адаптируют его к сохранению у людей. По этой логике он стал бы менее смертоносным и имел бы больше шансов распространиться. Но исследователи пока не обнаружили никаких признаков такого ослабления, вероятно, из-за эффективного механизма генетической репарации вируса.«Геном вируса COVID-19 очень стабилен, и я не вижу каких-либо изменений патогенности, вызванных мутацией вируса», — говорит Гуо Дэин, изучающий коронавирусы в Университете Сунь Ятсена в Гуанчжоу.

Rambaut тоже сомневается, что вирус со временем станет более мягким и пощадит своего хозяина. «Это не так, — говорит он. По его словам, до тех пор, пока он может успешно заражать новые клетки, воспроизводиться и передавать новые, не имеет значения, причиняет ли он вред хозяину.

Но другие думают, что есть шанс на лучший результат.Он может дать людям антитела, которые обеспечат хотя бы частичную защиту, говорит Клаус Штер, возглавлявший отдел исследований и эпидемиологии SARS Всемирной организации здравоохранения. Штер говорит, что иммунитет не будет идеальным — у людей, которые повторно заразились, по-прежнему будут развиваться незначительные симптомы, как при простуде, и будут редкие примеры тяжелых заболеваний. Но механизм проверки вируса означает, что он не будет быстро видоизменяться, а инфицированные люди сохранят надежную защиту, — говорит он.

«Безусловно, наиболее вероятный сценарий состоит в том, что вирус продолжит распространяться и заражать большую часть населения мира в относительно короткий период времени», — говорит Штер, имея в виду один-два года. «После этого вирус будет продолжать распространяться среди людей, вероятно, вечно». По словам Штера, как и четыре обычно легких коронавируса человека, SARS-CoV-2 будет постоянно циркулировать и вызывать в основном легкие инфекции верхних дыхательных путей. По этой причине, добавляет он, вакцины не понадобятся.

Некоторые предыдущие исследования подтверждают этот аргумент. Один ¹⁰ показал, что, когда люди были привиты простудным коронавирусом 229E, их уровни антител достигли пика через две недели и лишь немного повысились через год. Год спустя это не предотвратило инфекции, но последующие инфекции привели к небольшому количеству симптомов и более короткому периоду распространения вируса.

Коронавирус OC43 предлагает модель того, куда может пойти эта пандемия. Этот вирус также вызывает у людей простуду, но генетические исследования Левенского университета в Бельгии показывают, что OC43 мог быть убийцей в прошлом. ¹¹ .Это исследование показывает, что OC43 попал к людям примерно в 1890 году от коров, которые получили его от мышей. Ученые предполагают, что OC43 был ответственен за пандемию, унесшую жизни более миллиона человек во всем мире в 1889–1890 годах — вспышку, в которой ранее виноват грипп. Сегодня OC43 продолжает широко циркулировать, и, возможно, постоянное воздействие вируса сохраняет иммунитет к нему подавляющего большинства людей.

Но даже если этот процесс сделал OC43 менее смертоносным, пока не ясно, произойдет ли что-то подобное с SARS-CoV-2. Исследование на обезьянах показало, что они сохраняют антитела к SARS-CoV-2, но исследователи сообщили только в первые 28 дней после заражения, поэтому неясно, как долго сохранялся иммунитет ¹² . Концентрация антител против SARS-CoV также значительно снизилась за двух-трехлетний период ¹³ . Достаточно ли этих пониженных уровней для предотвращения заражения или уменьшения степени тяжести, не проверялось. Кошки, коровы, собаки и куры, похоже, не становятся невосприимчивыми к иногда смертельным коронавирусам, которые их заражают, в результате чего ветеринары на протяжении многих лет вынуждены бороться за вакцины.Несмотря на все вопросы о том, сохраняют ли люди какой-либо иммунитет к SARS-CoV-2, некоторые страны продвигают идею выдачи выжившим «паспортов иммунитета», чтобы они могли выходить на улицу, не опасаясь заразиться или заразить других.

Многие ученые отказываются от суждений о том, были ли когда-то укротители коронавирусов столь же опасными, как SARS-CoV-2. Людям нравится думать, что «другие коронавирусы были ужасными и стали легкими», — говорит Перлман. «Это оптимистичный способ думать о том, что происходит сейчас, но у нас нет доказательств.”

Внутри записной книжки инженера — Руководство по графическим наброскам: 9 шагов (с изображениями)

Наклонное графическое изображение начинается с прямого взгляда на одну из граней объекта, которая часто является лицевой стороной. Нарисованные под углом параллельные линии отображают глубину объекта. Обычные углы наклонной линии глубины составляют 30ᵒ, 45ᵒ и 60ᵒ. Есть несколько разных типов наклонных рисунков, есть кавалер, который использует точный размер линий для определения глубины, поэтому, если вы рисуете объект глубиной 2 см, тогда линия глубины будет иметь длину 2 см на соответствующий угол.Хотя это дает вам более точное изображение размеров объекта, он выглядит намного более искаженным и нереалистичным, чем другой тип, кабинет. На чертежах шкафа используются линии глубины, которые составляют половину фактической длины линии глубины. Этот метод делает его более реалистичным, но при этом позволяет рассчитать глубину объекта.

Для создания наклонных изображений лучше всего использовать метод «стеклянного ящика», когда вы рисуете воображаемый стеклянный ящик, окружающий объект, настолько плотный, насколько это возможно, но все же являющийся прямоугольной призмой.Я собираюсь продемонстрировать (на картинках выше), создав простую L-образную форму. Вот простой шаг за шагом, как использовать этот метод:

1. Нарисуйте прямоугольник, представляющий общую ширину и высоту передней грани «коробки». Убедитесь, что линии высоты вертикальны, а линии длины — горизонтальны. Это даст вам прямой вид спереди. (Рисунок 1)

2. Нарисуйте линии глубины до общей глубины, завершив прямоугольник. Не забудьте сделать линии глубины под углом 30ᵒ, 45ᵒ или 60ᵒ.Самый распространенный и простой в использовании угол — 45ᵒ, потому что вы можете сделать угол 45ᵒ на обычной миллиметровой бумаге, просто рисуя от угла к углу. (Рисунок 2)

3. Нарисуйте точки и вспомогательные линии, чтобы определить края граней объекта, которые находятся на внешней поверхности коробки, начиная с передней грани, затем верхней и боковых граней. (Рисунок 3)

4. Обведите вспомогательные линии линиями объектов, чтобы очертить края граней объекта, которые встречаются на внешних поверхностях коробки.(Рисунок 4)

5. Используя вспомогательные линии, нарисуйте остальные края внутри коробки (а также края, которые не видны), чтобы закончить форму. (Рисунок 5)

6. Обведите только что созданные вспомогательные линии линиями объектов, чтобы очертить оставшиеся линии. (Рисунок 6)

7. Иногда полезно добавить затенение, чтобы различить разные лица.

Совет: при затенении свет всегда идет сверху, поэтому верхние грани никогда не затеняются, они всегда остаются белыми.(Рисунок 7)

Другие инструменты химика UB: перьевая ручка, чернила и стилус — UB Now: новости и обзоры для преподавателей и сотрудников UB

Профиль

Химик UB Тимоти Кук рисовал с детства. Теперь, как работающему отцу, имеющему близнецов и малышей, искусство остается важной частью его жизни: способом творить и расслабляться после долгого дня. Позади Кука — фреска в Комплексе естественных наук с увеличенной иллюстрацией, вдохновленной и выложенной в форме периодической таблицы элементов.Фотографии: Дуглас Левере

ШАРЛОТТА HSU

Часто, когда день закончился — когда уроки и собрания закончились, и когда его младенческие близнецы и малыш наконец засыпали, — исследователь химии UB Тимоти Кук садится рисовать.

Он использует чувствительный к давлению стилус для рисования на своем планшете, работая при свете светящегося экрана. У него также есть большая коллекция перьевых ручек и чернил, некоторые из которых хранятся в его офисе в Комплексе естественных наук, другие — дома.Он скучает по ним и надеется скоро к ним вернуться — просто в последнее время это было легче создавать в цифровом виде, так как он часто держит ребенка на одной руке или работает в темноте в комнате своего 3-летнего ребенка, когда она уходит в постель. .

Его искусство часто напоминает его жизнь как ученого.

Он рисует химические структуры молекул, гексагональные формы бензолов, короткие линии сигнальных связей. Он вручную составляет фазовые диаграммы. Он иллюстрирует кристаллические решетки и орбитали, а также создает карикатуры, показывающие состояния материи: твердое, жидкое и газообразное.Он рисует электронно-лучевую трубку, кремниевый солнечный элемент, стальную двутавровую балку, блюдо с желтой серой.

Это искусство, полное простых линий, выражающих сложные идеи, появилось на обложке журнала Inorganic Chemistry; в стопках конспектов лекций он подготовил 105-й курс химии; на веб-сайтах лабораторий других ученых; и на стенах Комплекса естественных наук, где находится химический факультет, где UB установил фреску с одним из рисунков Кука, сильно стилизованным под периодическую таблицу Менделеева.

Тимоти Кук рисует на планшете в своем офисе в Комплексе естественных наук. Фото: Дуглас Левере

В наши дни возможности рисовать и каракули могут быть труднодостижимыми, поскольку Кук и его жена Сара Кук, фармацевтический исследователь из Enhanced Pharmacodynamics и дополнительный преподаватель в UB, работают вместе, чтобы вырастить троих маленьких детей. Тем не менее, Тимоти Кук при каждой возможности тянется к стилусу или ручке. И среди усталости — от родительских забот, от работы, от переживания пандемии — искусство дает ему возможность расслабиться после дня, проявить творческий подход, выразить себя.

«Я много думаю, как ученый и человек, о способности создавать вещи, а не о разрушении», — говорит Кук, доцент химии Колледжа искусств и наук, чья лаборатория специализируется на разработке самосборные материалы. «Мне нравится создавать молекулы, конструировать вещи и наводить порядок, и я думаю, что рисование тоже в этом роде. Есть элемент создания чего-то вроде приятного, связанного с тем временем, которое у нас здесь есть.

«Я ценю только создание вещей. Теперь, когда у меня есть трехлетний ребенок, приносящий домой произведения искусства из детского сада, я удвою это. Приятно видеть ее каракули и слушать, как она описывает эти фантастические произведения искусства… «Мама, сегодня я нарисовал всю твою жизнь темно-синим цветом!» Это так круто. И это не просто строки на странице; это может быть музыка, слова, песочные замки. Я считаю, что это так полезно, когда люди тратят время на что-то, и я люблю, люблю, люблю видеть, как мой ребенок — и, в конечном итоге, дети — идут по этому пути.”

Фреска в Комплексе естественных наук представляет собой увеличенную иллюстрацию Кука, вдохновленную и выложенную в форме периодической таблицы элементов. Установка была результатом сотрудничества химиков UB, команды по связям с общественностью Колледжа искусств и наук и University Communications. Фото: Дуглас Левере

Фреска в стиле периодической таблицы и рисунки на собраниях преподавателей

Эта фреска на втором этаже комплекса естественных наук UB представляет собой увеличенную иллюстрацию Кука — рисунок, вдохновленный и выложенный в форма периодической таблицы элементов. Нарисованные на научную тематику наброски уравнений, экспериментов и оборудования, отражающие исследовательские темы лабораторий всего Химического факультета, занимают центр таблицы. Установка была результатом сотрудничества химиков UB, команды по связям с общественностью Колледжа искусств и наук и University Communications.

«Многое из этого было сделано на собраниях преподавателей», — говорит Кук. «Я рисую на собраниях преподавателей, и я беспокоился, что мои коллеги подумают, что я не обращаю внимания, но я обращаю внимание — я просто чувствую себя очень обязанным рисовать и зарисовывать, пока слушаю.Когда я бываю на собраниях, я рисую молекулярные орбитали атомов, молекул и вещей. Просто я сосредотачиваюсь.

«Этот беспорядочный стиль начался в старшей школе, когда мой учитель рисования сказал мне, что мне нужно перестать пытаться рисовать все идеально и точно. Мне пришлось начать намеренно рисовать беспорядочные линии, которые не совсем соединялись, и шаткие круги, а потом это просто застряло ».

Кук также создал оригиналы для графики, которая появляется на окнах в Комплексе естественных наук, изображая концепции и уравнения, связанные с химией.

Обложка и любовь к перьевым ручкам

Обложка журнала «Неорганическая химия» от 18 мая. Тимоти Кук, доцент химии, нарисовал иллюстрацию от руки перьевой ручкой на бумаге, затем оцифровал и раскрасил. На чертеже изображены молекулярные строительные блоки, самоорганизующиеся в тетраэдрические структуры, которые сходятся на молекуле PFAS.

На этом рисунке показана самоорганизация молекул с образованием тетраэдрических ловушек, которые сходятся на загрязняющем веществе.Искусство появилось на обложке журнала «Неорганическая химия» от 18 мая, чтобы выделить исследование Кука и коллег-исследователей химии из UB Дайаны Ага, Крессы Риа П. Фулонг и Мэри Грейс Э. Гардиан.

Кук сделал набросок обложки вручную перьевой ручкой на бумаге, затем оцифровал и раскрасил.

Это было много месяцев назад.

В наши дни: «Я рисую на своем iPad, потому что ситуация часто буквально такова, что у меня на коленях лежит ребенок, а он спит, а iPad подпирает его, и я могу держать одну свободную руку на коленях. планшет », — говорит Кук.«Часто дети просыпаются, сейчас 2 часа ночи, и я не могу снова заснуть, поэтому я просто немного порисовываю».

Но перьевые ручки — его настоящая любовь, — говорит он, и «Я обязательно вернусь к этому. Мне очень нравится ощущение чернил на бумаге. Я просто знаю, что если я не сделаю это в цифровом формате, у меня никогда не будет времени. Перьевые ручки — своего рода — за ними нужно прилагать усилия — их нужно чистить, вы же не хотите, чтобы они высыхали.

«Помимо того, что я смотрел на них и говорил:« У меня есть эти ручки », я уже несколько месяцев не рисовал перьевыми ручками.Это как-то грустно. Я пойду на эти форумы, такие как The Fountain Pen Network, где люди говорят о ручках, и я все еще активно читаю о ручках и чернилах.

«Раньше мне нравилось читать лекции, я использовал камеру для документов и писал перьими ручками. Студенты хотели бы попробовать, и я предлагал им идеи для моделей перьевых ручек, которые они могли бы купить. У меня в офисе есть коробки с разными чернилами для перьевых ручек, и я предлагаю им попробовать любую из этих чернил в любое время. Студенты придут и получат маленькие пузырьки с чернилами для перьевых ручек.Я скучаю по всему этому, потому что сейчас пандемия, а ее не происходит. Я больше не в офисе. Но это случится снова — я снова стану лицом перьевых ручек на химическом факультете UB ».

Лекционные заметки и создание красоты

Страница из рукописных заметок Тимоти Кука по химии 105. Кредит: Тимоти Кук

Ручное рисование лекционных заметок для классов было одним из недавних начинаний Кука.

Каждая страница прекрасна.

Те, что для «Химии 105: Приложения и принципы» содержат рукописные комментарии, рисунки молекул, кристаллов и орбиталей, карикатуры ученых и иллюстрации известных экспериментов, таких как эксперимент с каплей масла и эксперимент с золотой фольгой. Раздел по термохимии, имеющий отношение к диете и макроэлементам, включает рисунок ярко-красного с радугой мешка с кеглями во время обсуждения калорий. Обзор передачи и преобразования энергии включает в себя изображения чайной чашки (открытая система), одноразовой кофейной чашки с крышкой (закрытая система) и изолированной столовой (изолированная система).

«Я решил написать от руки все свои общие заметки по химии на осенний и весенний семестр», — говорит Кук. «Студенты, кажется, действительно ценят это, и я чувствую себя обязанным делать для них все, что могу, в течение этих семестров COVID-19.Я отправляю свои заполненные заметки и версию с вычеркнутыми частями, которые затем заполняю во время лекции.

«Несмотря на то, что они написаны от руки, в них все преобразовано в текст в фоновом режиме, поэтому программы чтения с экрана должны иметь возможность анализировать текст. В моем классе студенты получают заметки, записанные лекции с подписями и учебник с альтернативными описаниями всех таблиц, рисунков и т. Д., Поэтому существует множество различных способов усвоения содержания ».

Логотипы лабораторий и использование искусства для выражения науки

Футболка, разработанная исследователем химии UB Тимоти Куком.

Кук говорит, что рисует «почти столько, сколько я себя помню». Его тётя, учёный и художник-акварелист, рано вдохновила его. Рисование и рисование стали его хобби в детстве: «Я бы тратил на это часы», — вспоминает он.

В училище решил специализироваться на химии, но продолжал рисовать. Он создал некоторые из своих первых цифровых изображений на планшете для рисования, который сейчас вышел на пенсию, который ему подарил отец. В то время рисунки в основном были вдохновлены текстами песен, хотя изредка появлялись научные темы.Недавнее искусство Кука дало ему возможность объединить свои интересы.

Он иллюстрировал логотипы или баннеры для веб-сайтов своей исследовательской группы и других лабораторий, в том числе своего научного руководителя Дэниела Ночера и заведующего кафедрой химии Университета Калифорнии Дэвида Уотсона. Кук также создал дизайн футболки (изображенный в этом разделе) со схемами знаковых исследовательских инструментов и молекулярных структур, а также со словами «UB CHEMISTRY», каждая буква, нарисованная белым как часть плитки периодической таблицы.

Кук говорит, что не только искусство является выходом для творчества, но и ценит то, что рисунок позволяет ему более ясно выражать себя как ученому.

«В отличие от того, когда я говорю« аммиак »и имею в виду аммоний, когда я рисую Nh5 +, вот и все: нет путаницы или возможности ошибиться, и это так решительно», — говорит он. «Я могу сообщить именно то, что хочу, потому что я не ограничен. Если я хочу нарисовать нарисованный полимер с самосборными клетками, я просто могу это сделать. Если я хочу показать нуклеофил, атакующий определенную часть молекулы или конкретную d-орбиталь, я могу написать это так, чтобы люди во всем мире могли понять.

«Слова намного сложнее. Я ограничен теми, которые я знаю, на одном языке, и у меня есть рот, который движется быстрее, чем мой мозг, поэтому мне приходится постоянно возвращаться. Итак, я думаю, что я пытаюсь сказать, что мне проще и эффективнее общаться с помощью рисунков ».

Другие инструменты химика UB: перьевая ручка, чернила и стилус

Тимоти Кук, доцент химии UB. Позади Кука находится фреска с увеличенной иллюстрацией, вдохновленной и выложенной в форме периодической таблицы элементов.Предоставлено: Дуглас Левер / Университет в Буффало. Средства массовой информации могут просматривать и загружать другие фотографии Кука и его работ.

Тимоти Кук подрабатывает как художник, с проектами, связывающими две страсти: науку и рисование

Дата выпуска: 31 марта 2021 г.

БУФФАЛО, Нью-Йорк — Часто, когда день подходит к концу — когда занятия и встречи окончены , и когда его младенческие близнецы и малыш наконец засыпают — исследователь химии из Университета Буффало Тимоти Кук садится рисовать.

Он использует чувствительный к давлению стилус для рисования на своем планшете, работая при свете светящегося экрана. У него также есть большая коллекция перьевых ручек и чернил, некоторые из которых хранятся в его офисе в Комплексе естественных наук в UB, а другие — дома. Он скучает по ним и надеется скоро к ним вернуться — просто в последнее время это было легче создавать в цифровом виде, так как он часто держит ребенка на одной руке или работает в темноте в комнате своего 3-летнего ребенка, когда она уходит в постель. .

Его искусство часто напоминает его жизнь как ученого.

Он рисует химические структуры молекул, гексагональные формы бензолов, короткие линии сигнальных связей. Он вручную составляет фазовые диаграммы. Он иллюстрирует кристаллические решетки и орбитали, а также создает карикатуры, показывающие состояния материи: твердое, жидкое и газообразное. Он рисует электронно-лучевую трубку, кремниевый солнечный элемент, стальную двутавровую балку, блюдо с желтой серой.

Тимоти Кук, доцент кафедры химии UB, зарисовки перьевой ручкой. Предоставлено: Дуглас Левер / Университет в Буффало. Средства массовой информации могут просматривать и загружать другие фотографии Кука и его работ.

Это искусство, полное простых линий, выражающих сложные идеи, появилось на обложке журнала Inorganic Chemistry; в стопках конспектов лекций он подготовил 105-й курс химии; на веб-сайтах лабораторий других ученых; и на стенах Комплекса естественных наук, где находится химический факультет, где UB установил фреску с одним из рисунков Кука, сильно стилизованным под периодическую таблицу Менделеева.

В наши дни возможности рисовать и каракули могут быть труднодостижимыми, так как Кук и его жена Сара Кук, доктор философии, фармацевтический исследователь из Enhanced Pharmacodynamics и дополнительный преподаватель в UB работают вместе, чтобы вырастить троих маленьких детей. Тем не менее, Тимоти Кук при каждой возможности тянется к стилусу или ручке. И среди усталости — от родительских забот, от работы, от переживания пандемии — искусство дает ему возможность расслабиться после дня, проявить творческий подход, выразить себя.

Химический исследователь из UB Тимоти Кук говорит, что держатели в виде крабов популярны среди энтузиастов перьевых ручек.Предоставлено: Дуглас Левер / Университет в Буффало. Средства массовой информации могут просматривать и загружать другие фотографии Кука и его работ.

«Я много думаю, как ученый и человек, о способности создавать вещи, а не о разрушении», — говорит Кук, доктор философии, доцент кафедры химии Колледжа искусств и наук UB, специализирующаяся на лаборатории. в конструкции самосборных материалов. «Мне нравится создавать молекулы, конструировать вещи и наводить порядок, и я думаю, что рисование тоже в этом роде.Есть элемент создания чего-то вроде приятного, связанного с тем временем, которое у нас здесь есть.

«Я ценю только создание вещей. Теперь, когда у меня есть трехлетний ребенок, приносящий домой произведения искусства из детского сада, я удвою это. Приятно видеть ее каракули и слушать, как она описывает эти фантастические произведения искусства… «Мама, сегодня я нарисовал всю твою жизнь темно-синим цветом!» Это так круто. И это не просто строки на странице, это может быть музыка, слова, песочные замки.Я считаю, что это так полезно, когда люди тратят время на что-то, и я люблю, люблю, люблю видеть своего ребенка, и, в конце концов, дети встают на этот путь ».

Настенная роспись в стиле периодической таблицы и рисунки на собраниях преподавателей

Тимоти Кук, доцент химии UB, гуляет по комплексу естественных наук. Позади него фреска с увеличенным изображением одной из его иллюстраций. Предоставлено: Дуглас Левер / Университет в Буффало. Средства массовой информации могут просматривать и загружать другие фотографии Кука и его работ.

На этой фреске на втором этаже комплекса естественных наук UB изображена увеличенная иллюстрация одной из иллюстраций Кука — рисунка, вдохновленного и выложенного в форме периодической таблицы элементов. Нарисованные на научную тематику наброски уравнений, экспериментов и оборудования, отражающие исследовательские темы лабораторий всего Химического факультета, занимают центр таблицы. Установка была результатом сотрудничества химиков UB, команды по связям с общественностью Колледжа искусств и наук и University Communications.

У исследователя химии из UB Тимоти Кука есть большая коллекция перьевых ручек и чернил, которые хранятся в его офисе в Комплексе естественных наук (NSC) UB и дома. Здесь он держит перьевую ручку, которую он использовал для создания иллюстрации, вдохновленной периодической таблицей элементов, которая была увеличена до фрески в NSC. Предоставлено: Дуглас Левер / Университет в Буффало. Средства массовой информации могут просматривать и загружать другие фотографии Кука и его работ.

Установка была результатом сотрудничества химиков UB, отдела коммуникаций Колледжа искусств и наук и University Communications.

«Многое из этого было сделано на собраниях преподавателей», — говорит Кук. «Я рисую на собраниях преподавателей, и я беспокоился, что мои коллеги подумают, что я не обращаю внимания, но я обращаю внимание — я просто чувствую себя очень обязанным рисовать и зарисовывать, пока слушаю. На встречах я рисую молекулярные орбитали, изображения атомов, молекул и прочего. Просто я сосредотачиваюсь.

«Этот беспорядочный стиль начался в старшей школе, когда мой учитель рисования сказал мне, что мне нужно перестать пытаться рисовать все идеально и точно.Мне пришлось начать намеренно рисовать беспорядочные линии, которые не совсем соединялись, и шаткие круги, а потом это просто застряло ».

Кук также создал оригиналы для графики, которая появляется на окнах в Комплексе естественных наук, изображая концепции и уравнения, связанные с химией.

СМИ могут просматривать и загружать другие фотографии Кука и его работ.

Обложка книги «Неорганическая химия» и любовь к перьевым ручкам

На этом рисунке показано, как молекулы собираются самостоятельно, образуя тетраэдрические ловушки, которые сходятся на загрязненном веществе.

Обложка журнала «Неорганическая химия» от 18 мая. Тимоти Кук, доцент кафедры химии UB, нарисовал иллюстрацию от руки перьевой ручкой на бумаге, затем оцифровал и раскрасил. На чертеже изображены молекулярные строительные блоки, самоорганизующиеся в тетраэдрические структуры, которые сходятся на молекуле PFAS. Скачать обложку с сайта журнала.

Изображение появилось на обложке журнала Inorganic Chemistry от 18 мая, чтобы осветить исследование Кука и коллег-исследователей химии из UB Дайаны Ага, доктора философии, Кресса Риа П.Фулонг, доктор философии, и Мэри Грейс Э. Гардиан, доктор философии.

Кук сделал набросок обложки вручную перьевой ручкой на бумаге, затем оцифровал и раскрасил.

Это было много месяцев назад.

В наши дни: «Я рисую на своем iPad, потому что ситуация часто буквально такова, что у меня на коленях лежит ребенок, а он спит, а iPad подпирает его, и я могу держать одну свободную руку на коленях. планшет », — говорит Кук. «Часто дети просыпаются, сейчас 2 часа ночи, и я не могу снова заснуть, поэтому я просто немного порисовываю.

Тимоти Кук, доцент кафедры химии UB, рисует на планшете в своем офисе в Комплексе естественных наук. Предоставлено: Дуглас Левер / Университет в Буффало. Средства массовой информации могут просматривать и загружать другие фотографии Кука и его работ.

Но перьевые ручки — его настоящая любовь, говорит он, и «Я обязательно вернусь к этому. Мне очень нравится ощущение чернил на бумаге. Я просто знаю, что если я не сделаю это в цифровом формате, у меня никогда не будет времени. Перьевые ручки — своего рода — за ними нужно прилагать усилия — их нужно чистить, вы же не хотите, чтобы они высыхали.

«Помимо того, что я смотрел на них и говорил:« У меня есть эти ручки », я уже несколько месяцев не рисовал перьевыми ручками. Это как-то грустно. Я пойду на эти форумы, такие как The Fountain Pen Network, где люди говорят о ручках, и я все еще активно читаю о ручках и чернилах.

Одна из специальных перьевых ручек химика UB Тимоти Кука. По его словам, этой ручке — подарку его исследовательской группы — больше века. Кук объясняет, что он был построен в 1910 году из чеканной резины и был отреставрирован.Предоставлено: Дуглас Левер / Университет в Буффало. Средства массовой информации могут просматривать и загружать другие фотографии Кука и его работ.

«Раньше я часто читал лекции, использовал камеру для документов и писал перьими ручками. Студенты хотели бы попробовать, и я предлагал им идеи для моделей перьевых ручек, которые они могли бы купить. У меня в офисе есть коробки с разными чернилами для перьевых ручек, и я предлагаю им попробовать любую из этих чернил в любое время. Студенты придут и получат маленькие пузырьки с чернилами для перьевых ручек.Я скучаю по всему этому, потому что сейчас пандемия, а ее не происходит. Я больше не в офисе. Но это случится снова — я снова стану лицом перьевых ручек на химическом факультете UB ».

Заметки к лекциям CHE 105 и создание чего-то прекрасного в мрачные времена

Страница из рукописных заметок Тимоти Кука для журнала Chemistry 105. Фото: Тимоти Кук. Средства массовой информации могут просматривать и загружать другие фотографии Кука и его работ.

Рисование конспектов лекций для классов от руки было одним из недавних начинаний Кука.

Каждая страница прекрасна.

Те, что для «Химии 105», содержат рукописные комментарии, рисунки молекул, кристаллов и орбиталей, карикатуры на ученых и иллюстрации известных экспериментов (например, эксперимент с каплей масла и эксперимент с золотой фольгой).

Раздел по термохимии, имеющий отношение к диете и макроэлементам, включает рисунок мешка с кеглями, ярко-красного цвета с радугой, во время обсуждения калорий. Обзор передачи и преобразования энергии включает в себя изображения чашки чая (открытая система), одноразовой чашки кофе с крышкой (закрытая система) и изолированной столовой (изолированная система).

Тимоти Кук, доцент химии UB, рисует на планшете в своем офисе в Комплексе естественных наук. Предоставлено: Дуглас Левер / Университет в Буффало. Средства массовой информации могут просматривать и загружать другие фотографии Кука и его работ.

«Я решил написать от руки все свои общие заметки по химии на осенний и весенний семестр», — говорит Кук. «Студенты, кажется, действительно ценят это, и я чувствую себя обязанным делать для них все, что могу, в течение этих семестров COVID-19.Я отправляю свои заполненные заметки и версию, в которой вычеркнуты части, которые я затем заполняю во время лекции.

«Несмотря на то, что они написаны от руки, в них все преобразовано в текст в фоновом режиме, поэтому программы чтения с экрана должны иметь возможность анализировать текст. В моем классе студенты получают заметки, записанные лекции с подписями и учебник с альтернативными описаниями всех таблиц, рисунков и т. Д., Так что есть много разных способов усвоить содержание ».

Логотипы лабораторий и использование искусства для выражения науки

Кук говорит, что рисовал «почти столько, сколько я себя помню.”

Футболка, разработанная исследователем химии UB Тимоти Куком. Предоставлено: Тимоти Кук. Средства массовой информации могут просматривать и загружать другие фотографии Кука и его работ.

Его тётя, учёный и художник-акварелист, рано вдохновляла его. Рисование и рисование стали его хобби в детстве: «Я бы тратил на это часы», — вспоминает он.

В училище решил специализироваться на химии, но продолжал рисовать. Он создал некоторые из своих первых цифровых изображений на планшете для рисования, который сейчас вышел на пенсию, который ему подарил отец.В то время рисунки в основном были вдохновлены текстами песен, хотя изредка появлялись научные темы. Недавнее искусство Кука дало ему возможность объединить свои интересы.

Кук проиллюстрировал логотипы или баннеры для веб-сайтов своей исследовательской группы и других лабораторий, в том числе своего научного руководителя Дэниела Ночера, доктора философии, и заведующего кафедрой химии Университета Калифорнии Дэвида Уотсона, доктора философии.

Химический исследователь из UB Тимоти Кук промокает перьевой ручкой бумажное полотенце, чтобы чернила потекли.Предоставлено: Дуглас Левер / Университет в Буффало. Средства массовой информации могут просматривать и загружать другие фотографии Кука и его работ.

Кук также создал дизайн футболки (изображенный в верхней части этого раздела) со схемами знаковых исследовательских инструментов и молекулярных структур, а также со словами «UB CHEMISTRY», каждая буква, нарисованная белым как часть таблицы Менделеева. плитка.

Кук говорит, что не только искусство является выходом для творчества, но и ценит то, что рисунок позволяет ему более ясно выражать себя как ученому.

Перьевые ручки в офисе исследователя химии UB Тимоти Кука. Предоставлено: Дуглас Левер / Университет в Буффало. Средства массовой информации могут просматривать и загружать другие фотографии Кука и его работ.

«В отличие от того, когда я говорю« аммиак »и имею в виду аммиак, когда я рисую Nh5 +, вот и все: нет путаницы или возможности ошибиться, и это так решительно», — говорит он. «Я могу сообщить именно то, что хочу, потому что я не ограничен. Если я хочу нарисовать нарисованный полимер с самосборными клетками, я просто могу это сделать.Если я хочу показать нуклеофил, атакующий определенную часть молекулы или конкретную d-орбиталь, я могу написать это так, чтобы люди во всем мире могли понять.

«Слова намного сложнее. Я ограничен теми, которые я знаю, на одном языке, и у меня есть рот, который движется быстрее, чем мой мозг, поэтому мне приходится постоянно возвращаться. Итак, я думаю, что я пытаюсь сказать, что мне проще и эффективнее общаться с помощью рисунков ».

Тимоти Кук, доцент кафедры химии из Университета естественных наук.Позади него находится фреска с увеличенной иллюстрацией, вдохновленной и выложенной в форме периодической таблицы элементов. Предоставлено: Дуглас Левер / Университет в Буффало. Средства массовой информации могут просматривать и загружать другие фотографии Кука и его работ.

Контактная информация для СМИ

3 Достижения в технологиях, имеющих отношение к биологии: перспективы будущего | Глобализация, биобезопасность и будущее наук о жизни

В прошлом коронавирусы, которые имеют самые большие геномы среди всех вирусов с положительной цепью РНК (длиной около 30 килобаз), было трудно реконструировать из-за огромного размера и нестабильности их полноразмерных клонов кДНК в бактериальных векторах. ⁷⁰ Однако последние технологические достижения позволили реконструировать даже эти крупнейшие из всех известных РНК-вирусов, ⁷¹ , включая возбудителя тяжелого острого респираторного синдрома (SARS), ранее не описанный коронавирус. ⁷²

Точно так же обратная генная инженерия вирусов с РНК с отрицательной цепью ⁷³ оказалась намного более сложной, учитывая тот факт, что геномы РНК этих вирусов не функционируют напрямую как информационные РНК и, таким образом, не приводят к возникновению инфекционных вирусных потомков, следующих за их введение в разрешительные клетки.Эти РНК требуют экспрессии определенных вирусных белков для создания копий генома с отрицательной цепью РНК и запуска репликативного цикла. Технология для этого была впервые разработана для вируса гриппа А в конце 1980-х — начале 1990-х годов. Подобно более ранним попыткам с вирусами с положительной цепью РНК, эти усилия не только значительно улучшили наше понимание того, как эти вирусы реплицируются, но также создали средства для генетического манипулирования вирусными геномами с целью создания новых вирусов для использования в качестве живых аттенуированных вакцин. или векторы. ⁷⁴

Первоначально обратная инженерия вируса гриппа требовала использования вспомогательных вирусов, которые обеспечивали белки и сегменты РНК, которые восстанавливали РНП in vitro (т. Е. Восстановленные комплексы рибонуклеопротеинов, содержащие РНК, транскрибируемую из молекулярно клонированной кДНК), необходимые для того, чтобы быть заразным трансфекция в клетки.