Розы по клеточкам: Рисунки по клеточкам роза — красивые и интересные

Рисунки по клеточкам роза - красивые и интересные

Рисунки по клеточкам роза

Роза – красивый и всеми любимый цветок. Роза нарисованная по клеточкам и подаренная близким людям способна подарить заряд хорошего настроения. Рисуя клеточки шаг за шагом, Вы сможете нарисовать красивый цветок.

Красивая роза по клеточкам

Бутон розы по клеточкам

Красная роза по клеточкам

Красивый узор из роз по клеточкам

Радужная роза по клеточкам

Розовая роза по клеточкам

Вьющаяся роза по клеточкам

Красочная роза по клеточкам

Простая роза по клеточкам

Большой бутон розы по клеточкам

Простая роза по клеточкам

Роза по клеточкам

Это может быть Вам интересно

Как нарисовать розу по клеточкам в тетради поэтапно

На клеточном листе можно создавать оригинальные рисунки при помощи квадратов, которые следует закрашивать яркими цветами. Так можно получить иллюстрации персонажей, цветов, фруктов и смайликов. Посмотрите, как нарисовать розу по клеточкам в тетради. Поэтапно, рисуя линии шаг за шагом, в итоге вы сможете нарисовать красивый цветок.

Необходимые материалы:

• лист в клеточку;
• простой карандаш;
• ластик и линейка;
• цветные карандаши или фломастеры.

Этапы рисования розы по клеточкам

Верхняя часть бутона цветка будет состоять из двух блоков, которые имеют по два и три квадрата. От нижних уголков ведем линии вниз, чтобы обвести клеточку. Так получим второй ряд контура.

Рисуем горизонтальный блок из четырех клеток. Под самой крайней правой клеткой вырисовываем квадрат. Также добавим вертикальный большой блок, состоящий из пяти фигур. По окончании обводим еще одну клеточку.

Рисуем три клеточки друг за другом. Внизу с левой стороны добавим еще одну геометрическую фигуру, после чего внизу дорисуем вертикальный блок из четырех клеток.

Контур розы следует завершить, и для этого дорисуем две клеточки по диагонали и шесть по горизонтали в качестве основания бутона.

Переходим к стеблю и листикам цветка. Вначале под основанием рисуем две клеточки. Затем ведем вниз линию, чтобы обвести еще семь квадратов. Отсчитываем от основания цветка три клетки, чтобы на четвертой получить две дополнительные фигуры.

С левой и правой стороны стебля рисуем по две клетки. С правого бока дорисовываем одну фигуру вниз, а затем еще пару раз по блоку, состоящие из двух клеток. Получаем готовый листик.

Также необходимо получить еще один лист с левой стороны. Для этого вначале добавим длину стебля. Поэтому обводим один квадрат по диагонали и переходим вниз на четыре клетки еще раз в бок.

От верхнего левого уголка ведем линии, чтобы получить блок из двух клеток. Также дорисовываем два квадрата по диагонали чуть выше блока.

Затем спускаемся вниз. Для этого выводим два блока по две клеточки и два квадрата.

Напоследок дорисуем линии контура лепестков на верхней части бутона при помощи клеток. Для этого добавим один квадрат с левого бока. Затем еще раз рисуем вниз по диагонали одну клетку и на конец – блок из двух фигур. Однако следует подняться чуть выше, чтобы заполнить пустое пространство еще одним горизонтальным блоком из трех квадратов.

Закрашиваем красными карандашами центр цветка.

Зелеными фломастерами или карандашами создаем листики и стебель розы.

Теперь напоследок используем темно-розовый цвет для создания контура бутона.

Так получим рисунок розы по клеточкам в личном дневнике или в обычной тетради.

Как нарисовать розу по клеточкам

2.2 (44%) 5 votes

Post Views: 336

Как нарисовать розу по клеточкам. Рисование розы по клеточкам в тетради

Рисование по клеточкам – это маленькие шажочки к большому искусству. Таким образом Вы сможете создавать маленькие наброски или целые картины, совершенно не утруждая себя различными сложными методами рисования. Рисуя по клеточкам, каждый может быть настоящим художникам. Тема этого урока – розы. Это одни из прекраснейших цветов, которые мы часто встречаем не только на картинах, но и на различных элементах декора. Эти цветы могут особенно украсить любой ежедневник, поэтому мы рассмотрим несколько вариантов, как нарисовать розу по клеточкам в тетради.

Начнем с легкого.

---

Нужно отметить, что раскрасить розу Вы можете в любой цвет. Главное – придерживаться место расположения клеточек.

 

---

Еще один не менее интересный вариант.

---

Стоит попробовать нарисовать и такую красочную розу с помощью фломастеров.

 

---

Еще одна красочная красавица с зелеными листиками.

---

Последний сложный пример картинки того, как нарисовать розу по клеточкам.

Оцените статью

Рисунки по клеточкам цветы: яркие и интересные

Цветок в горшке по клеточкам

Многие дети любят рисовать цветы. В нашей коллекции рисунков по клеточкам собраны яркие и красивые примеры, которые можно самостоятельно нарисовать в тетради. Рисунки цветов по клеточкам могут стать прекрасным подарком вашим родным и близким.

Красивый цветок с бантиком по клеточкам

Бутон розы по клеточкам

Яркая роза по клеточкам

Мак по клеточкам

Роза

Соцветие розы по клеточкам

Простая роза по клеточкам

Орхидея

Подсолнухи по клеточкам

Радужная роза

Красивый цветок

Фиалка по клеточкам

Красивый цветок — роза по клеточкам

Это может быть Вам интересно

Simple English Wikipedia, бесплатная энциклопедия

Это просто роза; он совершенен в каждый момент своего существования. У разновидностей шиповника обычно всего пять лепестков, что делает их двудольными. Желтая роза (Rosa foetida) опыляется пчелой

Роза - это разновидность цветущего куста. Его название происходит от латинского слова Rosa . ^[1] Цветки розы могут быть разных цветов: от хорошо известных красных роз или желтых роз до белых или пурпурных роз.Розы принадлежат к семейству растений, называемых розоцветными. Все розы изначально были дикими, и они родом из нескольких частей мира, Северной Америки, Европы, северо-западной Африки и многих частей Азии и Океании. Существует более 100 различных видов роз. Виды шиповника можно выращивать в садах, но большинство садовых роз - это сорта, выбранные людьми.

[2]

На протяжении сотен лет они были специально выведены для получения широкого спектра привычек выращивания и широкого диапазона цветов от темно-красного до белого, включая желтый и голубовато-лиловый.Многие розы обладают сильным приятным ароматом. У большинства роз есть колючки (неправильно названные шипами) на стеблях. Кусты роз способны переносить самые разные условия выращивания. Плод розы называют шиповником. У некоторых роз декоративные шиповники.

Розы широко используются во всем мире как символы любви, сочувствия или печали.

Роза широко используется как женское имя. Кроме того, розы защищаются от других хищников, пытающихся охотиться на них с помощью шипов, широко известной системы защиты.

Роза была священной для Венеры (мифология). Венера была римской богиней любви и красоты. ^[3] Он также был связан с Амуром (сыном Венеры). Он был римским богом желаний - в одном мифе он уронил нектар, и нектар пузырился из земли, как розы. ^[3] Роза также была священной для Вакха. Он был римским богом вина. ^[3]

Богатые римляне лежали на ложе с возложенными на них розами. Они носили розы, привязанные к шее.Все, что было сказано «под розой», считалось секретом. ^[3] Считается, что Клеопатра VII из Египта украсила пол своего дворца розами, прежде чем ее возлюбленный Марк Антоний посетил ее. ^[3]

Роза использовалась как символ любви на протяжении сотен лет. ^[3]

Цветок розы может быть разных размеров. Он может быть от 1/2 дюйма в диаметре до почти 7 дюймов. ^[2] Также розы можно использовать для получения хорошего аромата.Аромат розы исходит от крошечных парфюмерных желез на лепестках ^{[4] [5]} , которые можно увидеть в мощный микроскоп. Иногда лепестки роз сушат и упаковывают, чтобы вы могли использовать их для украшения или для аромата.

Розы очень часто можно увидеть в садах. Иногда они могут быть и на виноградниках. На большом винограднике куст роз высаживают в конце каждого ряда лоз. Пока розы остаются здоровыми, виноградари могут видеть, что их лозы здоровы. ^[4]

Сотни лет назад розы в садах людей выглядели иначе, чем большинство роз, выращиваемых сегодня. Этот сорт розы Tuscany Superb был открыт в 1837 году. ^[6]

Есть тысячи сортов роз, которые люди выращивают в садах и на фермах. Имена, используемые для описания различных типов, часто относятся к одному виду, который является основным предком этой группы, например, розы Gallica в основном произошли от Rosa gallica . У других групп есть несколько разных видов среди своих предков.Чайно-гибридные розы, розы флорибунда и английские розы сегодня наиболее распространены в садах. Они бывают разных цветов, таких как красный, желтый, оранжевый, розовый, фиолетовый и т. Д.

• роз Альба
• роз бурбон
• роз сентифолия
• Китайские розы
• Плетистые розы
• дамасских роз
• Английские розы
• роз Флорибунда
• роз Галлика
• Гибридная роза Bracteata
• Гибрид мускусных роз
• Вечный гибрид гибридных роз
• Чайно-гибридные розы
• Миниатюрные розы
• Кустовые розы Модерн
• Моховые розы
• роз Noisette
• роз Ругоза

В католической религии роза является символическим элементом Святого Розария; Сообщается, что Фра Анджелико, молящий четки на улице, увидел Богородицу с группой ангелов, предлагающих ей гимны и молитвы, пока они составляли венец из роз.Удивленный видением, он прервал молитву, и ангелы остановились; когда он снова помолился, он увидел ангелов, снова собирающих составить венец из роз для предложения Марии. ^[7]

Розы разного цвета имеют разное значение.

• Красный - красная роза - выражение любви. Красные розы обычно показывают глубокие чувства, такие как любовь, тоска или желание. Красные розы также можно использовать для выражения уважения, восхищения или преданности. Глубокая красная роза может быть использована для выражения сожаления и печали.Число красных роз тоже имеет особое значение. 12 красных роз - самое популярное число, которое дарить; это означает «Будь моим» и «Я люблю тебя». ^[8]

• Pink - Существует множество разновидностей розовой розы. Обычно розовые розы используются для выражения нежных эмоций, таких как восхищение, радость, благодарность и глубокая или бесконечная любовь. ^[8]
• Темно-розовый - Темно-розовые цветы розы могут означать глубокую благодарность и признательность. Темно-розовые розы также выражают элегантность и изящество. ^[8]
• Светло-розовый - Цветки светло-розовых роз являются символом приятности и невинности. ^[8]
• Белый - Белый цвет чистоты, невинности и священной любви. Он представляет любовь, которая вечна и продолжается после смерти. Белые розы обычно могут символизировать начало новой жизни, и невесты обычно держат их, когда она идет по проходу на своей свадьбе. В некоторых религиях белая роза может символизировать святость брака. Белые розы можно использовать для выражения сочувствия или смирения.Они также могут быть о духовных вещах. ^[8]
• Желтый - Желтые розы обычно используются как выражение изобилия. Желтые розы показывают солнечные чувства радости, тепла и иногда радости. Это символы дружбы и заботы. Желтая роза, в отличие от некоторых других роз, не означает и не выражает романтики. ^[8]
• Апельсин - Оранжевые розы напоминают большинству людей огненное пламя. Эти огненные цветы - символы страсти и энергии. Оранжевые розы можно использовать для выражения желания и гордости. ^[8]
• Бордовый - Бордовый цвет является символом красоты. ^[8]
• Зеленый - Зеленые розы (иногда это белые розы с оттенками зеленого) могут символизировать наилучшие пожелания, удачу и благословения для хорошей жизни или восстановления хорошего здоровья. ^[8]
• Синий - Голубые розы не встречаются в природе, поэтому они олицетворяют недостижимое или загадочное. Таким образом, синие розы демонстрируют стремление к целям, которых вы не можете достичь. Иногда они могут означать: «Я не могу тебя иметь, но я не могу перестать думать о тебе». ^[8]
• Черный - Черный цвет смерти и прощания. Черные розы показывают смерть чувства или идеи. Отправка черных роз кому-либо указывает на смерть отношений, а иногда может использоваться в захоронениях. ^[8]
• Violet and Purple - Фиолетовая или пурпурная роза может показывать защиту, а также чувство величия, королевской власти и великолепия. Эти розы используются для выражения обожания. ^[8]
• Лаванда - Лавандовая роза, как и ее цвет, демонстрирует очарование.Он также выражает «любовь с первого взгляда». ^[8]

• 
• 
• 
• 

  Чайно-гибридная роза, 'Mrs. Герберт Стивенс

Викискладе есть медиафайлы по теме Rosa .

,

Аромат розы | Растительная клетка

ВВЕДЕНИЕ

Цветочный аромат - это сложный характер, который определяется сложной смесью низкомолекулярных летучих молекул. В течение многих лет исследования цветочного аромата были сосредоточены на его химическом выяснении (Knudsen et al., 1993), и в результате были идентифицированы сотни соединений. Большинство этих соединений принадлежат к трем основным путям биосинтеза: фенилпропаноиды, производные жирных кислот и терпеноиды (Croteau and Karp, 1991).Хотя полные пути, ведущие к конечным продуктам, не охарактеризованы, описаны общие модификации, такие как гидроксилирование, ацетилирование и метилирование (Дударева, 2002).

Пока нет удобной системы моделей растений, которая позволяла бы химические и биохимические, а также прямые и обратные генетические исследования запаха цветов. Во многом это результат невидимости этого персонажа и его динамичности. Более того, хорошо зарекомендовавшая себя модельная система Arabidopsis обычно не подходит для этой цели, поскольку уровень летучих веществ, продуцируемых его цветками, чрезвычайно низок (Vainstein et al., 2001). В результате характеристика ферментов и генов, участвующих в производстве и испускании цветочного запаха, все еще находится на начальной стадии (Дударева и Пичерский, 2000). На сегодняшний день небольшое количество генов цветочного аромата было выделено с помощью классических биохимических подходов из растений с очень ароматными цветами, таких как Clarkia breweri и Antirrhinum majus (Vainstein et al., 2001). Современные инструменты геномики, протеомики и метаболомики могут преодолеть ограничения, присущие классическим исследованиям механизма производства и испускания ароматов.Действительно, несколько групп недавно использовали эти высокопроизводительные технологии для идентификации новых генов аромата во фруктовых и вегетативных тканях (Aharoni et al., 2000; Lange et al., 2000; Gang et al., 2001).

Лепестки являются основным источником ароматических соединений многих цветов, и производство / выброс аромата контролируется на стадии развития. На основе анализа экспрессии генов, связанных с запахом, клетки эпидермиса лепестков были предложены в качестве мест для производства и испускания запаха (Дударева, Пичерский, 2000; Колосова и др., 2001; Вайнштейн и др., 2001). Развитие лепестков у большинства растений можно разделить на две фазы: после зарождения лепестки демонстрируют медленную скорость роста, в основном в результате деления клеток; поздняя фаза характеризуется быстрым ростом, возникающим только в результате размножения клеток (Martin and Gerats, 1993; Ben-Nissan and Weiss, 1996). Пик производства и излучения запаха на поздних стадиях развития цветка, во время размножения клеток (Guterman et al., 2002). Другие вторичные метаболиты, участвующие в привлечении опылителей, такие как антоцианы и каротиноиды, также накапливаются до высоких уровней на этой более поздней стадии (Вишневецкий и др., 1999; Weiss, 2000).

На протяжении веков роза была самой важной культурой в цветоводстве. Род Rosa включает 200 видов и более 18 000 культурных сортов (Weiss, 1997; Гудин, 2000). При годовой стоимости около 10 миллиардов долларов розы используются в качестве срезанных цветов, горшечных растений и садовых растений. Их экономическое значение также заключается в использовании их лепестков в качестве источника натуральных ароматизаторов и ароматизаторов. Дамасская роза ( Rosa damascena ) - наиболее важный вид, используемый для производства розовой воды, аттара розы и эфирных масел в парфюмерной промышленности.Однако, несмотря на важность запаха, большинство современных сортов срезанных роз не обладают отчетливым ароматом (Zuker et al., 1998). Поскольку в течение многих лет основной целью был отбор по долголетию и наблюдалась потеря аромата, была предложена некоторая отрицательная корреляция между этими признаками (Barletta, 1995). Тем не менее, конкретные причины потери аромата в ходе селекционных программ остаются неизвестными. Несколько исследований были нацелены на летучие соединения, выделяемые старыми сортами розы, и сотни различных соединений, представляющих три основных пути - фенилпропаноиды, производные жирных кислот и терпеноиды - были идентифицированы у разных видов и сортов (Flament et al., 1993). Таким образом, лепестки роз представляют собой отличную систему для применения современных технологий геномики в поисках новых генов, участвующих в производстве ароматов. Действительно, недавнее исследование геномики, направленное на идентификацию генов, экспрессируемых в лепестках Rosa chinensis , привело к предполагаемой идентификации генов, участвующих в формировании запаха (Channeliere et al., 2002).

Здесь мы описываем использование геномики для изучения генетических и биохимических функций лепестков роз. База данных EST с аннотациями лепестков была создана из двух тетраплоидных сортов Rosa hybrida с контрастирующими фенотипами, а профили экспрессии выбранных клонов были выполнены с использованием анализа микрочипов.Подробный химический анализ летучих веществ вместе с идентификацией генов, связанных с вторичным метаболизмом, экспрессия которых совпадает с производством запахов, привели к открытию нескольких новых генов, связанных с ароматами цветов. Функциональная характеристика некоторых из этих генов привела к идентификации сесквитерпенсинтазы, участвующей в производстве гермакрена D, двух O -метилтрансфераз, участвующих в производстве 3,5-диметокситолуола, и спиртацетилтрансферазы, участвующей в образовании геранилацетат.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Лепесток розы EST База данных

Коллекция роз, включающая душистые «садовые» сорта, а также коммерческие сорта на срезку, использовалась для отбора сортов для этого исследования. Первоначальный отбор включал грубый анализ летучих соединений, продуцируемых цветами различных сортов, пигментов их лепестков и срока годности в вазе (данные не показаны). Для этой работы были выбраны два сорта с контрастирующими фенотипами: Fragrant Cloud (FC) и Golden Gate (GG) (Рисунок 1).Большие красные цветы FC обладают сильным запахом, накапливают антоцианы и имеют короткую жизнь в вазе, тогда как маленькие желтые цветы GG накапливают каротиноиды, имеют долгую жизнь в вазе и не имеют отчетливого запаха (Guterman et al., 2002). Подробный анализ газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС) свободного пространства цветков FC и GG был проведен для определения типа летучих веществ, выделяемых этими цветами (см. Дополнительные данные в Интернете), и количества основных групп летучих веществ представлены в таблице 1.Цветы FC выделяют многочисленные ароматические соединения, известные для роз (Flament et al., 1993), включая ароматические спирты, монотерпены, сесквитерпены и различные сложные эфиры. И наоборот, цветки GG выделяют почти исключительно метоксилированные фенолы (99% от общего количества летучих). Эти соединения практически не обнаруживаются человеческим носом. Анализ временной регуляции испускания летучих веществ в цветках FC и GG показал, что уровни большинства ароматических соединений достигают пика на стадиях 4-6 (Рисунок 1) развития цветка (данные не показаны).

Рисунок 1.

цветков роз сортов GG и FC на разных стадиях развития.

Таблица 1.

Основные классы летучих веществ, выделяемых FC и GG Flowers

Чтобы создать инфраструктуру для изучения взаимосвязей между последовательностями и фенотипами розы, мы создали две направленно клонированных библиотеки кДНК из лепестков стадии 4 FC и GG. Произвольно выбранные индивидуальные клоны секвенировали от 5'-конца, и векторные последовательности, 3'-последовательности низкого качества и артефакты были удалены.Высококачественная информация о последовательностях 2873 индивидуальных клонов, 1834 из FC и 1039 из GG, была аннотирована и организована в контиги (seeupplementaldataonline). В базе данных представлено очень большое количество уникальных генов (2139; 74% от общего числа EST). Из них 1288 генов были обнаружены только в базе данных FC, а 746 - только в базе данных GG. Большинство уникальных генов (1815; ~ 63% от общего количества EST) были обнаружены в виде одиночных генов, что указывает на низкую избыточность библиотек и предполагает, что лепестки роз являются очень богатым источником для добычи генов.Подобные дублирования были обнаружены в базах данных, специфичных для FC и GG. Тридцать семь процентов EST принадлежат контигам, начиная от низкой избыточности (от 2 до 5 EST на контиг, 299 обнаруженных контигов) до средней избыточности (от 6 до 9 EST на контиг, обнаружено 15 контигов) до высокой избыточности (≥10 EST на контиг). contig, найдено 10 контигов). Хотя большинство контигов с высокой степенью избыточности содержат EST от обоих сортов, два содержат EST только от FC (таблица 2), что указывает на специфическую для сорта экспрессию. Самый большой контиг в базе данных, показывающий сходство последовательностей с O -метилтрансферазой (OMT), содержит 40 EST с равным представительством для обоих сортов.

Таблица 2.

самых распространенных EST в базе данных Rose: обнаружены наибольшие контиги и распределение EST между FC и GG

Уникальные гены были разделены на 18 функциональных групп (таблица 3) в соответствии с Мюнхенским информационным центром белковых последовательностей (http://mips.gsf.de). Раздельный анализ баз данных для двух сортов показал, что распределение уникальных генов по функциональным группам практически идентично в базах данных FC и GG. Самая большая группа последовательностей лепестков, содержащая примерно одну треть всех уникальных генов (32%), демонстрирует гомологию (ожидаемое значение <1.0 E ^-5 ) с генами, кодирующими предсказанные белки с неизвестной функцией. Вторая по величине группа (17%) содержит уникальные последовательности, которые не имеют гомологов (ожидаемое значение ≤ 1.0 E ^-5 ), как показывает анализ BLAST против NR (база данных неизбыточных белков), EST всех растений (база данных EST_pln) и геномные последовательности Arabidopsis. Высокий процент ранее неизвестных последовательностей указывает на то, что лепестки роз являются интересным источником новых генов. Другая большая группа генов в базе данных роз (15%) представлена ​​белками, предположительно участвующими в метаболизме.Среди них 233 уникальных гена связаны с первичным метаболизмом и 96 (~ 5% от общего количества EST) кодируют ферменты, предположительно участвующие во вторичном метаболизме.

Таблица 3.

Функциональная классификация генов лепестков роз

Анализ экспрессии генов лепестков роз

Чтобы идентифицировать гены, экспрессия которых совпадает с продуцированием запаха, микроматричный анализ был выполнен с 350 выбранными уникальными генами из FC. EST, напечатанные на слайдах, имели следующие предполагаемые функции: первичный и вторичный метаболизм, развитие, транскрипция, рост клеток, биогенез и организация клеток, спасение клеток, трансдукция сигналов и EST с неизвестной функцией.Каждое предметное стекло содержало по три копии всей матрицы. Для обеспечения достоверности результатов для каждого эксперимента использовали два предметных стекла микроматрицы (шесть повторов). Для каждого анализа готовили два независимых препарата РНК, и мечение кДНК (Cy3 по сравнению с Cy5) было обращено на втором слайде. РНК экстрагировали из лепестков FC и GG на стадии 4 и использовали в качестве зондов для сравнения экспрессии генов между двумя сортами. На рисунках 2A и 2B показаны два массива (этап 4 FC по сравнению с этапом 4 GG) с взаимной маркировкой, а диаграмма рассеяния сигналов от этих двух массивов представлена ​​на рисунке 2C.Коэффициент корреляции отношений из этих двух массивов составлял 0,95, что свидетельствует о хорошей воспроизводимости среди отдельных массивов в одном эксперименте. Используя двукратное изменение экспрессии генов в качестве порога (Ma et al., 2001), 77 генов (22% напечатанных кДНК) показали более высокую экспрессию в лепестках FC, чем в лепестках GG (Рисунок 3A). Примерно 270 генов (~ 77%) показали аналогичную экспрессию в двух разновидностях, а 3 гена (1,0%) показали более высокую экспрессию в лепестках GG. Во второй серии экспериментов уровень экспрессии выбранных генов на чипах сравнивали между лепестками FC на этапах 1 и 4.Эти результаты показывают, что 65 генов (18,5%) были активированы во время развития лепестков FC и 14 генов (4%) были репрессированы (Рисунок 3B). Приблизительно 270 генов (~ 77%) демонстрировали сходные уровни экспрессии в молодых (стадия 1) и развитых (стадия 4) лепестках FC.

Рисунок 2.

Оценка анализа микрочипов.

(A) Наложенное изображение микроматрицы, гибридизированной с меченой кДНК, происходящей из лепестков FC на стадии 4 (Cy3) и лепестков GG на той же стадии (Cy5).

(B) Наложенное изображение того же микроматрицы, что и в (A) , гибридизированном с теми же зондами, но с обратной маркировкой.

(C) Диаграмма рассеяния средних значений сигнала трех повторов на микрочипе. Поли (A) ⁺ РНК выделяли из лепестков FC на стадии 4 и из лепестков GG на той же стадии, подвергали обратной транскрипции и метили Cy5 и Cy3. В первом эксперименте РНК FC была помечена Cy3, а GG РНК была помечена Cy5, а во втором эксперименте мечение было обратным. Были нанесены значения ln отношения Cy5-to-Cy3.

Рис. 3.

профилей экспрессии выбранных генов роз.

(A) Распределение генов розы в соответствии с соотношением экспрессии в лепестках FC стадии 4 по сравнению с лепестками GG стадии 4. Соотношение для каждого клона представляет собой среднее значение шести повторов, взятых из двух независимых экспериментов. Пороговые значения обозначены вертикальными линиями.

(B) То же, что и в (A) , но сравнивая экспрессию в лепестках FC на стадии 1 по сравнению со стадией 4.

(C) Диаграмма взаимосвязи дифференциально экспрессируемых генов, которые демонстрировали повышенную экспрессию во время созревания лепестков FC и более высокая экспрессия в зрелых (стадия 4) лепестках FC по сравнению с лепестками GG.Порог повышенной экспрессии был двукратным. Число в перекрывающейся области указывает количество уникальных генов, которые проявляли повышающую регуляцию в обоих экспериментах.

Поскольку большинство ароматических соединений продуцируются лепестками FC на стадии 4, но не на стадии 1 (Guterman et al., 2002), а не лепестками GG, мы перекрыли EST, экспрессия которых повышается во время развития лепестков FC, с теми, которые показывают более высокую экспрессию в стадия-4 FC по сравнению с лепестками стадии-4 GG (рисунок 3C). Этот анализ выявил 40 уникальных генов, которые активировались во время созревания лепестков FC и демонстрировали более высокую экспрессию в FC, чем в цветках GG (см. Дополнительные данные в Интернете).Пятнадцать из этих генов (38%) были отнесены к функциональной группе метаболизма, семь из которых предположительно играли роль во вторичном метаболизме (Таблица 4). Хотя пять из них показали относительно умеренную дифференциальную экспрессию, FC0284 и FC0592 продемонстрировали очень сильную активацию. Эти клоны аналогичны ранее идентифицированным генам глутаматдекарбоксилазы и (+) - δ-кадиненсинтазы (сесквитерпенсинтазы) соответственно.

Таблица 4.

Неполный список генов, экспрессия которых повышается во время созревания лепестков FC и выше в зрелых лепестках FC, чем в зрелых лепестках GG, по данным анализа микрочипов

Поскольку лепестки FC и GG различаются по размеру и цвету, неудивительно, что гены, предположительно участвующие в этих признаках, также были представлены среди 40 клонов, обнаруженных при анализе перекрытия (таблица 4).Например, гены, связанные с ростом клеток, включают предполагаемую ксилоглюкановую эндотрансгликозилазу (Schünmann et al., 1997) и GAST-подобный ген (Shi et al., 1992). Кроме того, гены, возможно, участвующие в продукции антоцианов, включают предполагаемую дигидрофлавонолредуктазу и ген, подобный регулятору транскрипции myb26 (Uimari and Strommer, 1997).

Поскольку лепестки FC продуцируют и выделяют высокие уровни сесквитерпенов (Таблица 1), мы подробно охарактеризовали клон FC0592, последовательность которого показывает сходство с генами семейства сесквитерпенсинтаз (Рисунок 4).Этот клон имеет длину 2092 п.н. и имеет открытую рамку считывания, кодирующую 565 аминокислот. Расчетная последовательность белка показала наибольшее сходство (53% идентичности) с расчетной последовательностью (+) - δ-кадинен-синтазы хлопка, сесквитерпен-синтазы, участвующей в биосинтезе противогрибковых соединений (Chen et al., 1995). FC0592 принадлежит к одному из крупнейших контигов в базе данных, содержащему 17 EST, все из FC (таблица 2), что предполагает экспрессию, специфичную для сорта. Чтобы дополнительно охарактеризовать пространственную и временную экспрессию этого гена, был проведен гель-блот-анализ РНК (рис. 5).Высокий уровень экспрессии был обнаружен в зрелых лепестках FC (стадии 4–6), но не в молодых лепестках (стадия 1) или в молодых или зрелых листьях. В GG не было обнаружено экспрессии этого гена ни в одной из проанализированных тканей, включая зрелые лепестки.

Рис. 4.

Сопоставление выведенной аминокислотной последовательности FC0592 (предполагаемая розовая гермакрен D-синтаза) с хлопковой (+) - δ-кадинен-синтазой и томатной гермакрен-С-синтазой.

Аминокислоты, консервативные во всех трех последовательностях, закрашены черным, а консервативные только в двух последовательностях - серым.

Рисунок 5. Гель-блот-анализ

РНК предполагаемой сесквитерпен-синтазы.

Суммарную РНК экстрагировали из молодых (YL) и зрелых (ML) листьев FC и GG и из лепестков FC и GG на разных стадиях развития (1, 2, 4 и 6) и анализировали на экспрессию FC0592.

Функциональный анализ генов, связанных с запахом розы

Чтобы определить, кодирует ли этот клон сесквитерпен-синтазу и идентифицировать тип продуцируемого сесквитерпена, всю рамку считывания FC0592 клонировали в вектор экспрессии для получения каталитически активного рекомбинантного фермента.Анализы in vitro с использованием лизатов бактерий, избыточно продуцирующих продукт гена FC0592 и субстрат фарнезилдифосфат (FPP), привели к синтезу сесквитерпена, идентифицированного с помощью ГХ-МС как гермакрен D (рис. 6). Гермакрен D не был обнаружен в контрольных анализах, приготовленных из лизатов, полученных из бактериальных клеток, экспрессирующих неродственный ген. На Фигуре 6С показаны структуры субстрата FPP и продукта - гермакрена D. В условиях нашего анализа не было обнаружено монотерпенов, когда геранилдифосфат был представлен в качестве субстрата для продукта гена FC0592.Однако нельзя исключать способность этого белка использовать геранилдифосфат in vivo.

Рисунок 6. Функциональный анализ

клона FC0592 в E. coli .

Лизаты, экстрагированные из E. coli , сверхэкспрессирующего клон FC0592, инкубировали с FPP в буфере для анализа, и продукт реакции анализировали с помощью GC-MS.

(A) Одноионная ГХ-МС хроматограмма гексановых экстрактов бактериальных лизатов, полученных из клеток со сверхэкспрессией FC0592 или из клеток со сверхэкспрессией FC1018, используемых в качестве контроля.

(B) Полученный сесквитерпен имел масс-спектр, соответствующий спектру гермакрена D (идентичность 99%) по сравнению с компьютеризированной библиотекой NIST98. Индекс Ковача этого соединения также соответствовал индексу подлинного гермакрена D. Эти свойства были идентичны свойствам подлинного гермакрена D, присутствующего в коммерческом эфирном масле Cananga odorata .

(C) Химическая структура FPP и продукта реакции гермакрена D.

Анализ свободного пространства лепестков FC и GG выявил эмиссию сесквитерпенов у обоих сортов (таблица 5). Интересно, что несколько сесквитерпенов, идентифицированных в свободном пространстве GG, не были обнаружены в свободном пространстве цветков FC и наоборот. Тем не менее, общий уровень сесквитерпенов, выделяемых цветками FC, был намного выше (∼30 раз), чем уровень, выделяемый цветками GG. Аналогичным образом, активность сесквитерпенсинтазы в бесклеточных экстрактах была намного выше в FC, чем в лепестках GG (6.0 против 0,2 фкат / мг белка, соответственно; данные не показаны). Основным сесквитерпеном, идентифицированным в свободном пространстве цветков FC, был гермакрен D (~ 60% выделяемых сесквитерпенов). Эмиссию гермакрена D во время развития цветка оценивали с помощью анализа свободного пространства. Эмиссия гермакрена D из лепестков FC резко увеличивалась во время раскрытия цветка, достигая максимального значения на стадии 4 (рис. 7). Напротив, гермакрен D не был обнаружен в свободном пространстве цветков GG на любой стадии цветения.

Таблица 5.

Сесквитерпены, выделяемые из FC и GG Flowers

Рис. 7.

Germacrene D Выбросы из лепестков роз во время развития.

Уровни гермакрена D измеряли с использованием метода свободного пространства, описанного в разделе «Методы». Цветки FC и GG отбирали на разных стадиях развития цветка. Каждая точка представляет в среднем от трех до пяти индивидуально отобранных цветов. Гермакрен D идентифицировали с помощью ГХ-МС.

Для поиска дополнительных генов, связанных с запахом, мы искали EST, экспрессия которых увеличивается во время развития лепестков FC, как было выявлено анализом микроматрицы, независимо от уровня их экспрессии в GG.Среди этих 88 уникальных генов, предполагаемые функции вторичного метаболизма включают предполагаемую алкогольацетилтрансферазу, два предполагаемых OMT (OMT1 и OMT2) и последовательности, сильно похожие на известные монотерпенсинтазы, декарбоксилазы, гидроксилазы, аминотрансферазы и альдегиддегидрогеназы (рис. ). Гель-блот-анализ выбранных клонов на РНК подтвердил результаты микроматрицы: уровень их экспрессии увеличивался во время созревания лепестков FC. Для некоторых EST активация от стадии 1 к стадии 4 также была обнаружена в лепестках GG (Рисунок 8).Функции предполагаемой алкогольацетилтрансферазы и двух OMT были подтверждены in vitro с использованием лизатов из Escherichia coli , экспрессирующих эти гены. Предполагаемая спиртовая ацетилтрансфераза катализирует перенос ацильной группы ацетил-КоА на несколько спиртовых акцепторных субстратов, имея наивысшую каталитическую эффективность по отношению к геранилацетату, продуцирующему гераниол (наши неопубликованные данные). Оба ОМТ могут метилировать различные фенольные субстраты, используя S -аденозилметионин в качестве донора метила.OMT1 показал самую высокую каталитическую эффективность по отношению к орцинолу и продуцировал метиловый эфир орцинола, а OMT2 наиболее эффективно использовал метиловый эфир орцинола для получения диметилового эфира орцинола (Lavid et al., 2002). Следует отметить, что геранилацетат, метил и диметиловый эфир орцинола находятся в свободном пространстве цветов FC и GG (см. Дополнительные данные в Интернете).

Рисунок 8.

генов роз с предполагаемой ролью во вторичном метаболизме, экспрессия которых повышается во время созревания лепестков FC, что выявлено с помощью микроматрицы и / или анализа гель-блоттинга РНК.

н.д., не анализировался. ^a Ген, функционально идентифицированный как спирт-ацетил-КоА: ацетилтрансфераза. ^b Ген, функционально идентифицированный как S -аденозилметионин: орцинолметилтрансфераза (OMT1). ^c Ген, функционально идентифицированный как S -аденозилметионин: метилтрансфераза орцинолметилового эфира (OMT2).

ОБСУЖДЕНИЕ

За последнее десятилетие две системы растений: Clarkia breweri (Дударева, Пичерский, 2000) и Antirrhinum majus (Дударева и др., 2000), широко использовались для идентификации и характеристики генов цветочного запаха. Поскольку подходы прямой генетики невозможно было использовать (Vainstein et al., 2001), в этих исследованиях использовались биохимические инструменты (например, от активности ферментов через очистку белков до клонирования генов; Дударева и др., 1996, 1998). Совсем недавно подходы к геномике были адаптированы для изучения генов, контролирующих биосинтез как цветочных, так и растительных летучих веществ, поскольку эти новые методы позволяют быстро получить доступ к растениям с плохой генетической характеристикой (Aharoni et al., 2000; Lange et al., 2000; Gang et al., 2001; Channeliere et al., 2002). Более того, эти современные инструменты позволяют выбрать систему растений для изучения в соответствии с интересующим признаком, а не ограничиваться установленными модельными системами (Fiehn et al., 2000). Здесь мы использовали инструменты геномики для выявления новых генов запаха в лепестках роз. Объединив анализ базы данных EST с метаболическим профилированием и анализом экспрессии на микроматрицах, мы смогли идентифицировать несколько новых генов, участвующих в производстве ароматов в лепестках роз.

Лепесток розы ESTs

Лепестки с их пигментами и ароматами вносят основной вклад в привлекательность розовых цветов; как таковые, они несут ответственность за экономическую ценность завода. Мы создали аннотированную базу данных EST по лепесткам из двух сортов R. hybrida с контрастирующими фенотипами: старый садовый сорт с большими красными ароматными цветками, которые имеют короткий срок хранения в вазе (FC), и современный сорт срезанных цветов с мелкими желтыми цветками и только слабый запах, но долгая жизнь в вазе (GG).Библиотеки кДНК лепестков, использованные в данном исследовании для создания базы данных EST, не были нормализованы, что позволяло оценить уровень экспрессии конкретных генов на основе соответствующих размеров контигов. Кроме того, наличие определенного контига только в одном сорте предполагает экспрессию, специфичную для данного сорта. Действительно, для нескольких проанализированных клонов мы обнаружили хорошую корреляцию между количеством EST в контиге и уровнем их транскриптов. Например, контиг сесквитерпен-синтазы является одним из крупнейших в базе данных, он содержит 17 EST, все из FC.Высокая экспрессия этого гена в FC, но не в лепестках GG была подтверждена с помощью гель-блоттинга РНК. Кроме того, в двух крупных контигах были обнаружены два ОМТ. Эти контиги содержали EST от FC и GG: 12 EST от GG и 20 EST от FC представляли OMT1, а 14 GG EST и 26 FC EST представляли OMT2. Гель-блот-анализ РНК подтвердил высокую экспрессию этих OMT в обоих сортах (рис. 8).

Аннотация в базе данных для обоих сортов выявила относительно низкую избыточность (Sterky et al., 1998), причем более ∼60% от общего количества EST были обнаружены как одиночные. Это предполагает наличие большой коллекции генов со сходным представлением в библиотеке и, следовательно, возможно, схожей экспрессией в ткани. Совместная экспрессия множества уникальных генов может потребоваться как для быстрого роста лепестков, так и для продукции многих соединений в результате первичного и вторичного метаболизма. Действительно, каталогизация уникальных генов по функциональным группам выявила большой набор белков, которые предположительно участвуют в метаболизме (~ 16%) и росте и организации клеток (~ 5%).Более 30% белков первой группы могут участвовать во вторичном метаболизме. Более того, гены, связанные со вторичным метаболизмом, по-видимому, экспрессируются на очень высоких уровнях в зрелых лепестках, на что указывает размер контигов: почти половина самых крупных контигов (≥10 EST) в базе данных роз содержат гены, предположительно участвующие во вторичном метаболизме. Также вероятно, что среди группы новых неизвестных последовательностей обнаруживаются дополнительные кДНК, участвующие во вторичном метаболизме, потому что гены вторичного метаболизма, вероятно, будут наиболее дивергентными среди геномов растений и, следовательно, их труднее идентифицировать как таковые только путем сравнения последовательностей (Пичерский и банда, 2000).

За последние несколько лет было создано множество баз данных EST, использующих модели, а также экономически важные системы предприятия. Хотя для этого анализа использовались различные органы растений, информация об EST, специфичных для лепестков, только начала накапливаться (Vainstein et al., 2001; Channeliere et al., 2002). Ограниченное количество опубликованных EST, специфичных для лепестков, может объяснить относительно большое количество EST для лепестков розы (~ 17%), представляющих новые предполагаемые белки без значительного сходства (значение E ≥ 10 ^-5 ) с последовательностями в базе данных.Наблюдение за тем, что некоторые из этих EST были обнаружены в контигах, содержащих как последовательности FC, так и GG, подтверждает подлинность этих белков. Подобные результаты были недавно получены Channeliere et al. (2002), которые использовали лепестки R. chinensis , предка R. hybrida , для создания базы данных EST. Большая группа новых последовательностей также была обнаружена в базах данных лепестковых EST C. breweri (13%) (https://sativa.biology.lsa.umich.edu/blast/blast.html; логин, clarkia; пароль , пивоварня).Сравнение этих новых последовательностей C. breweri и розы выявило только одно совпадение. Быстрый прогресс в накоплении геномных последовательностей разных видов, а также EST из различных органов / специализированных тканей должен показать, являются ли эти новые предполагаемые белки специфичными для лепестков и / или уникальными для роз. С этой целью доступность базы данных R. chinesis для интеллектуального анализа данных должна иметь большое значение.

Хотя лепестки FC и GG фенотипически различаются, распределение EST, выделенных от двух сортов, между различными функциональными группами почти идентично.Таким образом, лепестки FC и GG, вероятно, экспрессируют сходный набор генов, определяющих природу органа. С другой стороны, их окончательный внешний вид, включая запах, может определяться относительно небольшим количеством генов, которые экспрессируются в зависимости от сорта. На основании профилей экспрессии и аннотации последовательностей были идентифицированы несколько генов с предполагаемыми функциями вторичного метаболизма в целом и производства запахов в частности (таблица 4, рисунки 6 и 8). Среди них гены, предположительно участвующие в реакциях модификации, таких как гидроксилирование, ацетилирование и метилирование.Используя систему экспрессии E. coli , были подтверждены биохимические функции алкоголяцетилтрансферазы (наши неопубликованные данные), двух орцинолметилтрансфераз (Lavid et al., 2002) и сесквитерпенсинтазы (рис. 8).

Гены, связанные с запахом розы

Одной из основных групп летучих веществ, выделяемых цветками FC, являются сесквитерпены. Аналогично

.