Радуга по клеточкам: Радужные рисунки по клеткам

Узнаем как правильно нарисовать радугу красиво

Рисовать тяжело, это знает каждый. Уже в раннем детстве можно определить, есть ли у ребенка склонность к изобразительному искусству, потому что рисунки талантливых детей будут разительно отличаться от всех остальных. Но это совсем не значит, что сразу же нужно отказываться от рисования и пытаться найти себя в других сферах, ведь научиться рисовать может буквально каждый. Конечно, если у вас нет таланта, то вы не станете вторым Пикассо или Дали, но вы вполне можете добиться достаточных высот — важно только правильно начать. Не хвататься за сложные рисунки, а узнать сначала, например, как нарисовать радугу.

Радуга карандашами

Лучше всего начинать учиться рисовать любые изображения карандашами, потому что именно с их помощью можно освоить базу без особых проблем. И если вы захотите узнать, как нарисовать радугу карандашами, то на этот вопрос будет гораздо легче найти ответ. На самом деле, все очень просто — если вы хотите нарисовать самую обыкновенную радугу, без бликов, без детального фона, то вам достаточно лишь начертить семь дуг на небольшом расстоянии друг от друга, причем чем выше дуга на рисунке, тем больше она будет. Важная деталь, которая должна быть знакома каждому — это цвета. При рисовании радуги вам понадобится 7 цветных карандашей — красный, оранжевый, желтый, зеленый, голубой, синий и фиолетовый. Существует большое количество интересных стихотворений и фраз, позволяющих запомнить порядок цветов в радуге. И если вы знаете порядок, имеете в наличии нужные цвета, то дело остается за малым — зарисовать начерченные ранее дуги нужными цветами так, чтобы получилась большая семицветная дуга. Вот вы и узнали, как нарисовать радугу.

Радуга красками

Если вы осилили рисование радуги карандашами, и теперь этот процесс не доставляет вам никаких проблем, то теперь вы можете переходить на новый уровень. Сейчас вам нужно узнать, как нарисовать радугу с помощью красок, что немного сложнее. Карандаши оставляют за собой четкий след, в то время как след краски за кистью нужно уметь контролировать. Сперва постарайтесь научиться рисовать хотя бы одну дугу; можете для начала начертить её карандашом, а затем уж закрашивать краской. Со временем вы «набьете руку», и карандашные наброски уже не понадобятся. Не стоит бояться, что дуги будут заходить друг на друга — это можно использовать в собственных целях, ведь если делать это аккуратно, то радуга будет смотреться более целостно и эффектно. И у вас больше не возникнет вопроса, как нарисовать радугу.

Немного о пони

Учитывая нынешнюю популярность мультсериала My Little Pony, многие дети, научившись рисовать радугу, захотят узнать, как нарисовать пони радуга. Это один из главных персонажей мультфильма, в оригинале называется Rainbow Dash. Его отличие от обычного пони в том, что хвост и грива у него имеют цвета радуги. Естественно, есть и свои особенности тела, например, большие глаза, но это уже можно подкорректировать в процессе совершенствования техники. Главное, когда изучаете вопрос о том, как нарисовать радугу дэш, помнить о его гриве и хвосте, которые должны быть цвета радуги, то есть иметь семь цветов. И тогда вы сможете нарисовать и обычную радугу, и популярного персонажа мультфильма.

class — Готовим руку к письму

Вы хотите красиво и аккуратно писать? Для этого необходимо развивать мелкую моторику, то есть движения мелких мышц кисти руки. Также мелкая моторика напрямую связана с развитием речи. В головном мозге человека центры, отвечающие за речь и движения пальцев рук расположены очень близко. Стимулируя мелкую моторику и активизируя соответствующие отделы мозга, мы активизируем и соседние зоны, отвечающие за речь.
 

Упражнения для координации движений пальцев, кисти, предплечья и плеча.
 

1. Ладони лежат на столе. Поднимать пальцы по одному сначала одной руки, затем другой. Упражнение повторяется в обратном порядке.
2. Ладони лежат на столе. Поднимать пальцы сразу обеих рук, начиная с мизинца.
3. Зажать ручку (или карандаш, фломастер) средним и указательным пальцами. Сгибать и разгибать эти пальцы, следя, чтоб ручка не опускалась ниже большого пальца.
4. На столе лежат 10 карандашей. Одной рукой собрать в кулак карандаши, беря их по одному, затем также по одному положить их обратно на стол.
5. Зажать карандаш вторыми фалангами указательного и среднего пальцев и «шагать» по поверхности стола.
6. Представить, что в ладонях находится мячик, и совершать движения, имитирующие поворачивание мячика в разные стороны.
7. Зажать конец ручки указательным и средним пальцами правой руки и, переворачивая ручку, вкладывать ее длинным концом в левую руку, и обратно. При этом нужно контролировать, чтобы руки упирались в край стола, локти чуть свешивались, а ладони были приподняты над поверхностью. Тогда ручка будет вращаться правильно — в вертикальной плоскости.

Один из самых эффективных способов развития мелкой моторики игры-шнуровки:

В играх с шнурованием развивается глазомер, внимание, происходит укрепление пальцев и всей кисти руки. Существуют и сюжетные шнуровки («Наряди ёлочку», «Помоги ёжику собрать урожай» ). Сюжетные шнуровки бывают разной степени сложности. Такие игры можно сделать самостоятельно: на плотный картон приклеить или нарисовать картинку, дыроколом сделать отверстия.

Пластилин – прекрасное средство для развития мелкой моторики. При этом лепка способствует формированию воображения, фантазии и способности творчески мыслить. Из пластилина можно делать фигурки, создавать композиции, отпечатывать на пластилине различные оттиски предметов и даже рисовать пластилином картины.

Очень полезно изготовление мозаики из мелких пластилиновых шариков. Подробнее

Штриховка, раскрашивание, рисование узоров по клеточкам, обведение контуров помогают отработке начальных графических навыков и правильную постановку руки.

Штриховка укрепляет мышцы руки, вырабатывает умения действовать по заданным правилам и планировать свои действия, способствует развитию внимания, аккуратности и способности доводить начатое дело до конца.
Важно соблюдать

основные правила штриховки: не выходить за контур, соблюдать параллельность линий и расстояние между ними, не проводить один штрих дважды.

Рисовании (обведении контуров) по точкам вырабатывает умение правильно держать карандаш и правильно направлять его.
Возможны разные варианты упражнений:
-закрасить отмеченные фрагменты, чтобы получилась картинка,
-обвести по точкам контуры рисунков,
-нарисовать по образцу,
-соединить точки по цифрам и по буквам (соединение в обратном порядке повышает трудность задания)
— пройти лабиринт и др.
Получившиеся рисунки можно использовать как раскраски.

 Послушный карандаш — графические задания для развития мелкой моторики, зрительного восприятия и внимания: штриховка, раскрашивание, рисование узоров, обведение контуров, дорисовки.

Задания для рисования и раскрашивания можно скачать и распечатать  http://razukras.ru/categories.php?cat_id=45

Для успешного обучения важна синхронная работа правого и левого полушария. Очень полезны обведение или рисование симметричных рисунков сразу двумя руками. При этом происходит координация ведущей и ведомой руки, зрительного и пространственного восприятия, тренировка мелких мышц руки.

Такие задания можно найти в книгах:

• И. Мальцева  Прописи для правшей и левшей.
• М. Ткачёва  Послушный карандаш. Рисуем обеими руками. Смотреть здесь
• М. Ткачёва  От линии к линии. Рисуем обеими руками.
• Прописи. Русуем двумя руками. Смотреть здесь
• Прописи-рисовалки для обеих рук

Графические диктанты : рисуем по клеточкам.
Ещё 13 графических диктантов
 

Развитие мелкой моторики в быту
1.     Снимать шкурку с овощей, сваренных в мундире. Очищать крутые яйца. Чистить мандарины.
2.     Разбирать расколотые орехи (ядра от скорлупок). Отшелушивать пленку с жаренных орехов.
3.     Собирать рассыпавшиеся предметы (пуговицы, гвоздики, фасоль, бусинки).
4.     Лепить из теста печенье.
5.     Сматывать нитки или веревку в клубок.
6.     Вешать белье, используя прищепки (нужно натянуть веревку для ребенка).
7.     Помогать отвинчивать различные пробки — у канистр с водой, пены для ванн, зубной пасты и т.п.
8.     Перебирать крупу.
9.     Рвать, мять бумагу и набивать ей убираемую на хранение обувь.
10.   Собирать на даче или в лесу ягоды.
11.   Искать край скотча. Отлеплять и прилеплять наклейки.
12.   Затачивать карандаши (точилкой)

Как нарисовать радугу: карандашом и красками

Рисуем разноцветную радугу обычными и цветными карандашами, акварельными красками, гуашью самостоятельно по пошаговой инструкции с детьми. Как нарисовать рисунок радуги, по клеточкам, с цветовым переходом и без? Раскраски Пони Дэш, Единорог.

Знакомимся вместе с детьми с пошаговой инструкцией, как нарисовать радугу:

• по фото, шаблонам рисунков для срисовки и без них;
• поэтапно по цветам, применяя простые и цветные карандаши, акварельные краски и гуашь;
• прорисовкой разноцветных дуг без перехода цвета и с плавным его схождением.

Радуга – природный феномен. Красивое явление световых дуг рождает преломление солнечных лучей в капельках влаги в небе после дождя. Яркий радужный мост играет всеми цветами.

Завидя небесный цветной свод, каждый хочет его сфотографировать на телефон или фотоаппарат. Запомните семицветный образ, начните сами его  рисовать, научитесь и передайте это искусство своему чадо.

Изображение сияющей радуги на бумаге рисуем традиционным методом с секретами для стимулирования заинтересованности начинающих художников. В ход идёт все – краски, грифельные стержни – простые серые и цветные, фломастеры, пластилин.

Наблюдайте за ребёнком, каким материалом ему проще работать!

Правильно рисуем радугу

Простым карандашом

Научившись красиво пошагово выводить линии серым грифелем, появится возможность изображать её в других пейзажах, на кавайных картинках.

Для работы возьмите 7 цветов, не используйте сразу все цветовые оттенки.

Воспользуйтесь набором для рисования:

• Листом бумаги А4.
• Обычным карандашом (чёрным маркером).
• Ластиком для коррекции.
• Карандашами разных цветов.

Тема: «Выполняем рисунок» (конспект занятия):

• Шаг 1. Набросок. Изобразите два небольших овала (быстрыми движениями не прорисовывая контур) в верхней части левого угла листа и внизу правого угла (круг, полукруг).

• Шаг 2. Доработка овалов. На основе овалов создайте воздушные, красивые облака, добавляя внутрь них волнообразные полоски любых размеров, на усмотрение.

• Шаг 3. Нанесение дуг. От первого облака слева вверху проведите 8 одинаковых дугообразных линий ко второму нижнему облаку справа. Получатся цветные дужки.

• Шаг 4. Усиление контура наброска. Чёрным маркером аккуратно обводите все линии на рисунке.
• Шаг 5. Добавление красок. Карандашом синего цвета легко разукрасьте облака, полностью не закрашивая.
• Шаг 6. Внесение цветов внутрь дуг. Красным карандашом раскрасьте ребята верхнюю полоску, далее берёте очередной карандаш – оранжевый, жёлтый, зелёный, голубой, синий и фиолетовый, закрашивая каждую полоску своим оттенком.

Мультик – раскраска – нарисовать для детей:

Видеоканал “Рыба – Кит”:

Разноцветными карандашами, красками, гуашью: цвета по порядку

Изобразить радугу можно любым материалом нетрадиционным способом. Цвета должны идти по порядку.

Ватными палочками:

• Смачиваем палочки в каждой краске отдельно.
• Соединяем их в линию наподобие гребешка.
• Проводим по бумаге.

Деревянная палочка или губка для мытья посуды:

• На палитру выдавливаем краски.
• Мочим в них губку, кладем плашмя палочку, или обмакиваем её кончик.
• Проводим (или ставим точечно) губкой или палочкой по бумаге.

Для плавности переходов наносите краски широкой кисточкой:

• Намочите бумагу красками.
• Отставьте, чтобы влага впиталась.
• Проведите широкой кистью!

Нарисуем гуашью. Знаете, что в радуге представлены по порядку такие цвета:

1. Красный.
2. Оранжевый.
3. Жёлтый.
4. Зелёный.
5. Голубой.
6. Синий.
7. Фиолетовый.

Детские присказки для запоминания цветов знают все:

• «Каждый охотник желает знать, где сидит фазан».
• «Как однажды Жак звонарь головой сломал фонарь» (вариации – сшиб, снёс, сбил).

Для взрослых:

• «Карлсон опять жизнерадостно задумал гадость с фрикадельками»

Рисуем без цветового перехода

Новичку рисовать трудно. Если ребёнок не имеет склонности – картинки получаются бедные по содержанию. Нужно научить его свободно пользоваться цветами. Талант приложится.

Для получения изображения без контуров учитесь выводить черту грифелем. После этого, можно перейти к краскам.

Обыкновенная радуга, не имеющая цветовых переходов:

• Рисуете обыкновенным карандашом на малом расстоянии друг от друга 7 дуг.

• Прорисовываете карандашами отдельно по цветам каждую полосу заготовки, не заступая за линию.

Научились? Тогда пользуйтесь красками.

Рисунок по клеточкам

Урок лёгкий, вперед в мастер класс! Готовьте фломастеры и лист в клетку.

Этап 1. Красный цвет:

• Фломастером ближе к верхней части листа посередине штрихуем по горизонтали 5 клеток.
• Спускаясь по диагонали, впереди и сзади заштриховываем еще по два деления.
• Повторяем последнее действие ещё раз.
• Отступая в стороны по диагонали, продолжаем разрисовывать красным по одной ячейке.
• Теперь, также отходя в стороны на одно деление, начинаем штриховать по одной клетке вертикально вниз.
• Аналогично предыдущему пункту, вертикально вниз закрашиваем еще пару клеточек.
• Получилась красная полоса дугой вниз. Она занимает 17 клеток в ширину и 6 в высоту.

Этап 2. Добавление остальных цветов:

• Берём и дорисуем ниже жёлтым цветом ещё дугу под красной полоской в таком же количестве клеток, примыкая вплотную.

• Сделайте внутри жёлтого силуэта все предыдущие действия зелёным фломастером.

• Аналогично с фломастером синего, затем фиолетового цветов, получая, таким образом, цветовую арку из пяти цветов.

Этап 5. Нарисуем облака:

• Давайте, в правой части радуги, снизу, добавьте 7 синих клеточек.
• Далее, отступив, штрихуем 1 ячейку.
• Отступая еще вниз, вправо и влево, закрашиваем по 2 клетки вертикально.
• Затем, выполняем схождение контура будущего овала, спускаясь вниз и внутрь по одной клетке по диагонали, закрасив их.
• Соединяем овал синим цветом пятью клеточками посередине, отступив вниз по центру на один уровень.

Можете нарисовать на облаках глаза как на рисунке. Должна получиться примерно такая картинка:

Нарисовать по клеточкам:

Нарисовать единорога по клеткам простой тетради, развивающее видео:

Радуга детскими руками

Детские рисунки выражают настроение маленьких творцов. Если они рисуют полную радугу, значит с их эмоциональным состоянием все в порядке.

Чтобы стимулировать творческие способности, пусть ребёнок увидит:

• фон брызг рядом с водопадом или фонтаном в солнечный день;
• небо после окончания дождика, когда сквозь тучки пробиваются лучи солнышка (бывает, что одновременно появляются 2 семицветных дуги).

Фото рисунков солнца и радуги для срисовки

1. Приготовьте детям инструменты для рисования.
2. Выделите рабочее место.
3. Выберете шаблон, по нему нарисовать легче.
4. Разукрашиваем первый рисунок совместно с ними.

Пони Дэш

Видео: Нарисовать Пони Дэш мелками на полянке, сделайте гриву, нос, рот:

Нарисовать Пегас Пони Rainbow Dash:

Подпишись на новости этого сайта.

С уважением, автор.

Главная — ЛогоСветиК

Отзывы

Спасибо Вам, Ольга Витальевна, за Ваш БОЖЕСТВЕННЫЙ ТРУД для наших детишек!

Меня зовут Лена. Я очень благодарна Ольге Витальевне и считаю, что нам повезло, что мы ее нашли.

Мы пришли на занятия, Жене было 3 с половиной года. Он все умел делать, все понимал, но только совсем не мог говорить. Ни одного звука… Он очень хотел, но у него не получалось. И он очень болезненно это переносил, злился, раздражался, что мы его не понимаем. Только по жесту руки мы знали, что он хочет. Но и то не всегда именно то, что он хотел сказать. Другие, даже бабушки, его вообще не понимали.

И когда мы стали ходить на занятия к Ольге Витальевне, Женя впервые стал воспроизводить звуки. Мы начинали с песенки домика “У-О-А-Э-Ы”. Так вот, Женя когда научился говорить самый первый звук “У”, брал меня за руку, показывал на дверь и произносил “У-У”. Я понимала, что, мол, пойдем, к Ольге Витальевне. Он так поначалу и здоровался одним звуком.

Но потом пошли и другие звуки. Жене было очень трудно из себя их “доставать”. Но он очень любил цифры, и Ольга Витальевна, подметив его “конек”, использовала его интерес. И тут еще быстрее пошла работа.

Женя начал постепенно пропевать все склады. Потом мы перешли на слова. Он тут же начал читать. Через 3 месяца мы поехали в отпуск, и я поняла, что Женя все — таки заговорил! Он уже говорил все, что видел. При этом он просил, чтобы я написала это слово, ему было легче его увидеть, прочитать и проговорить. Вот так мы сразу и говорить, и читать научились.

Я так и написала тогда Ольге Витальевне, будучи в отпуске. Что 3 с половиной года мы пытались его разговорить, куда только не водили. А тут за 3 месяца — случилось ЧУДО! Он заговорил и зачитал! Я очень благодарна Ольге Витальевне за такую чудесную, ну просто уникальную систему! Даже не верится, что так бывает, но оно случилось, все получилось!!! Наш Женечка ГОВОРИТ!!!

Очень рада за себя, а то я чего только не передумала, что, мол, такая мама… что ребенку речи не дала… Но все хорошо сейчас! Я уже так о себе не думаю.

Спасибо Вам, Ольга Витальевна, за Ваш БОЖЕСТВЕННЫЙ ТРУД для наших детишек!

С любовью и уважением — Лена Б., г. Подольск МО

 

Хочу сказать огромное спасибо Ольге Витальевне!

Здравствуйте, меня зовут Ирина.

Хочу сказать огромное спасибо Ольге Витальевне и рассказать нашу историю.  Сейчас моему младшему сыну Роме 7 лет.

Год назад, к шести годам, мы с мужем забили тревогу. Ромка не выговаривал много звуков. Это и «Р», и «Л», все шипящие «Ш», «Ж», «Щ», «Ч», нечетко произносил «С», «З». Ему ставили диагноз «дислалия». Думали, что к 5 — 6 годам само выправится. Но впереди уже школа…

Через Московский Логопедический Центр «Людмила» нашли Ольгу Витальевну. Занятия были на дому. Ромка, домашний ребенок, не ходил в сад, но с Ольгой Витальевной они сразу нашли общий язык. Не боялся, не стеснялся, ждал занятий, которые проходили в игровой форме, но в то же время были серьезными и где-то даже трудными, но Рома этого не замечал.

Занятия начались с логопедического зондового массажа, артикуляционной гимнастики, постановки звуков, выработки правильного дыхания… На следующем этапе для отработки звуков в слогах подключились «Кубики Зайцева», «Домики букв». Рома стал запоминать слоги, читать односложные слова прямо на глазах.

Ольга Витальевна работала над тем, как правильно построить предложение, всячески подбадривала, помогая ему не бояться выражать свои мысли, говорить уверенным сильным голосом. Дополнительно Роме был показан алгоритм математических вычислений по таблице Зайцева, давались специальные логические задания, которые Рома выполнял с большим удовольствием.

За небольшое время наш сын стал выговаривать все звуки чисто, научился читать, даже считать, решать логические задачи, обобщать. Мы перестали бояться школы!

Огромная, искренняя благодарность Ольге Витальевне за ее профессионализм, доброту, участие, за неравнодушие к своим ученикам.  Спасибо от всей души».

 

…В конце курса Амалия не хотела расставаться!

Ольга Витальевна, я Вам очень благодарна за Амалию!

Амалия в 6 лет не выговаривала «л» твердую и «р» мягкую и твердую. Амалии было очень тяжело, ей не хотелось заниматься. Ольга Витальевна сумела заинтересовать и увлечь Алю, а результаты появились очень быстро. В конце курса Амалия не хотела расставаться!

Ольга Витальевна замечательный и талантливый логопед, педагог и психолог, которая к каждому ребенку находит свой подход.

С уважением, Новинская Елена.

Амалия просила передать Вам наилучшие пожелания!!!

 

Ольга Витальевна — очень внимательный, добрый и умеющий найти подход к каждому ребенку логопед

Мы обратились к Ольге Витальевне, как к логопеду, для помощи моему сыну (6 лет). У Ромы были проблемы с произношением нескольких звуков, но благодаря занятиям эти проблемы почти решены. Осталось лишь еще поработать над автоматизацией в произношении поставленных звуков.

Ольга Витальевна — очень внимательный, добрый и умеющий найти подход к каждому ребенку логопед.

Ольга Витальевна, спасибо большое за Ваши прекрасные занятия и за дополнительные советы по обучению чтению и счету до 100 по Н. Зайцеву!

Лена. 

 

Моя доченька стала лучше читать, поверила в себя, в свои силы учиться…

Хочу поблагодарить Ольгу Витальевну за ее работу и за ту веру в себя, которую она способна открыть в детях. Моей старшей дочери 9 лет. В прошлом году мы переехали и во второй класс она пошла в новую школу. С чтением у Вареньки и до перевода в новую школу не все ладилось, а тут совсем стало плохо. Читала по слогам, путала буквы и придумывала окончания в словах. Отсюда стали появляться и проблемы с другими предметами в школе.
Ольгу Витальевну нам порекомендовали наши знакомые, которые оказались в восторге от результата уже после первого занятия.
Честно говоря, за прошлый год мы много чего перепробовали, и я была настроена,мягко говоря, скептически.
Но за время занятий моя доченька не только стала лучше читать, но и поверила в себя, в свои силы учиться, появилось желание читать.
У нас еще много работы, Варя пока не может читать бегло, но теперь она знает, что у нее все получится.

Горина Виктория, модельер-конструктор.

 

Ольга Витальевна сумела найти к нему подход, и они прекрасно занимались.

Меня зовут Ольга. Водила к Ольге Витальевне двух своих мальчишек. Сначала первого. Когда-то он не мог заговорить. Ольга Витальевна его как-то быстро научила, и мы забыли об этом…

Но потом второй мой сын также не мог выйти в речь. А я тогда уже не знала, где Ольга Витальевна работает, она уже на тот момент ушла из детского центра. И мне пришлось приложить немало усилий, чтобы отыскать ее телефон и где она живет.

И мы пришли с моим младшеньким вновь к ней.

Младший был с таким “особым” характером, что я просто не справлялась. А Ольга Витальевна сумела найти к нему подход, и они прекрасно занимались. И тут еще такая система у нее интересная, что мне кажется, любого ребенка можно научить и говорить, и читать, и считать.

Я очень благодарна Ольге Витальевне за обоих моих мальчишек. Не знаю, чтобы я делала, если бы не она и ее система! БЛАГОДАРЮ!!!!!!!!!!!!!!!!

С уважением — Ольга П., г. Подольск

 

Благодаря этой системе, благодаря золотому сердцу и характеру Ольги Витальевны, мы медленно, но верно пришли к результату.

Я от всего сердца хочу поблагодарить Ольгу Витальевну за нашего Костика. Даже сложно представить, что было бы, если бы не она с ее огромным любящим сердцем…

Просто наш сын с рождения воспитывался не в нашей семье, а там, где детям не дают развития. Мы его усыновили.

И он в 4 года вообще мало чего знал, ничего не говорил, и не воспринимал вообще людей, молчал, дичился. Все одно к одному. Мы не знали сами, как подобрать к нему “ключик”. И вот через Логопедический Московский Центр “Людмила” нам дали координаты Ольги Витальевны.

Оказалось, что мы близко живем. И первый раз она сама к нам пришла. И сразу все поняла…

Потом мы к ней ходили. Медленно очень привыкали. И нам потребовалось больше, чем 3 месяца, заниматься по Программе, потому что был неординарный случай, видимо.

Но что хочу сказать. Благодаря этой системе, благодаря золотому сердцу и характеру Ольги Витальевны, мы медленно, но верно пришли к результату. А потом даже опередили его сверстников, потому что Ольга Витальевна заложила такие азы грамоты речи, что это мало где дается и делается. Мы больше такого не встречали больше нигде.

После полугода занятий с Ольгой Витальевной мы стали заниматься самостоятельно. Но я уже знала системный подход, ведь я его наблюдала на занятиях, да и дома мы занимались по схеме. И у нас Костик делал успехи.

Я с радостью разделила свой опыт, потому что если вдруг кому надо такая помощь, обращайтесь к Ольге Витальевне! Это то, что нужно вашим детям. Это тот человек, который нужен вашим детям.

Огромное человеческое спасибо Вам, Ольга Витальевна!

С любовью и благодарностью — Светлана, г. Подольск

 

Когда мы обратились за помощью, дочери Лерочке было 3,5 года, а в речи ее ВСЕГО 4 СЛОВА…

Большое спасибо Ольге Витальевне за эффективную работу с моей дочерью!

Когда мы обратились за помощью, дочери Лерочке было 3,5 года,а в речи ее всего 4 слова. Через 4 месяца занятий с Ольгой Витальевной она стала читать слоги и произносить отдельные слова. А еще через 2 месяца-говорить простыми предложениями и считать до 20.

Были периоды,когда Лера отказывалась заниматься, но Ольга Витальевна сумела ее заинтересовать играми и музыкой, так что очень скоро ребенок с радостью бежал на занятия и даже дома сама просилась заниматься. Ольга Витальевна подсказала, как мне самой с ней заниматься, и мы до сих пор занимаемся с Лерой по ее советам и рекомендациям.

Сейчас дочери 4,5 года, говорит сложные предложения, поет песни, рассказывает сказки, считает до 100 и читает по слогам. Из звуков пока не получается только «Р». Но самое главное, что Лера поняла, как это прекрасно-уметь говорить!

Спасибо Ольге Витальевне за профессионализм, доброту, терпение, любовь к детям и индивидуальный подход к каждому ребенку!

Ирина.

 

И здесь мы за полтора месяца получили результат!

Мы водили дочку — первоклассницу на индивидуальные занятия. Нам посоветовала учительница. Потому что дочка никак не могла запомнить букв и начать читать.

И здесь мы за полтора месяца получили результат!

Безумно рады. А то бы пришлось нам снова оставаться в первом классе на следующий год.

Спасибо Учителю — Ольге Витальевне.

С.Ш.

 

И я заметила, и преподаватель по русскому языку, что у Саши пошли изменения в лучшую сторону.

Мой сын (7 класс) ходил на индивидуальные занятия к Ольге Витальевне. Я очень хотела, чтобы у него исправилась дисграфия и дислексия. Мальчик способный, а здесь были двойки. Занимались полгода. И я заметила, и преподаватель по русскому языку, что у Саши пошли изменения в лучшую сторону. Он даже четверки стал получать.

Чтобы не было таких проблем как у сына, я своей маленькой дочке (ей 3 годика) тоже купила Кубики Зайцева. И они теперь вместе с братом играют. И всем радость и польза!

Большое спасибо за такую находку и за моего сына! С уважением — Анна Г.

 

Нам очень повезло, что именно Ольга будет заниматься с моим сыном.

Огромная благодарность Ольге за ее работу! Сыну 4 года, не выговаривает правильно много звуков, а говорит очень быстро. Не всегда понятно получается. Очень обижается, когда его не понимают.

На консультации Ольга объяснила все моменты. Очень приятно общаться с таким добрым, отзывчивым и любящим детей профессионалом. Нам очень повезло, что именно Ольга будет заниматься с моим сыном.

Татьяна Майбурова, г. Москва.

 

Дочка дома играла в Ольгу Витальевну, обучая нас с мужем составлять слова…

Мою дочь зовут Ольга. Мы занимались сначала в гр. «Зайки — Читайки». Научились. И пошли на следующий год в гр. «Зайки — Считайки».

Моя дочка всегда торопилась идти на занятие, так ей нравилось. Она дома играла в Ольгу Витальевну, обучая нас с мужем составлять слова, прочитывать их, пропевая.

Огромное спасибо говорим Ольге Витальевне за то, что посеяли в дочке, я в этом уверена, желание учиться!

Анастасия.

 

Мои девчонки зачитали в 4 с половиной года!

Мне очень понравилась занятия «Зайки — Читайки. Я водила на них своих девчонок — двойняшек с 3-х уже лет. Мы постепенно, играючи прошли все буквы, склады и домики. И мои девчонки зачитали в 4 с половиной года!

Спасибо Ольге Витальевне!!!

С уважением и любовью — Антонина.

 

Ольга очень вежливо и доброжелательно поговорила с сыном.

Я обратилась к Ольге с запросом проконсультировать меня по произношению 5-летнего сына, который иногда повторяет последние слоги слов и чересчур четко проговаривает Р в словах :)) Я спрашивала также, могу ли я самостоятельно это откорректировать или нужно обращаться к специалисту.

Ольга очень вежливо и доброжелательно поговорила с сыном в моем присутствии, расспросила его про увлечения, про фантазии, просила прочитать стишок и спеть песенку (со стишком еще более-менее, а вот с песенкой у нас вышел полный провал).

В итоге по моим вопросам оказалось всё довольно просто: т.к. сын недавно самостоятельно научился выговаривать Р (буквально пару месяцев назад), он продолжает тренировать свои языковые и др.мышцы, и со временем это пройдет. Это радует!

С повторением слогов слов — тут меня Ольга обнадежила, что как раз пение песенок и заучивание и проговаривание стихов поможет наладить речь в «автоматическом режиме», и пока обращаться к специалисту не нужно. Еще Ольга посоветовала давать слушать сыну запись им же проговоренных стихов и песенок. Это улучшит восприятие ребенка его же речи.

Благодарю Вас, Ольга за консультацию. Мои сомнения рассеялись и сейчас слушаем с ребенком песенки и потихоньку подпеваем любимому Чебурашке 🙂

С уважением, Дроздова Ольга.

 

И я бы и третьего привела, и четвертого сюда…

Мы занимались у Ольги Витальевны сначала со старшим сыном, потом я привела младшего. И я бы и третьего привела, и четвертого сюда, насколько этот Педагог умеет дать ребенку то, что необходимо: это и любовь, и внимание, и знание, и умение.

Удивляюсь, как она при своей мягкости и спокойствии умеет удержать внимание, дисциплину на занятиях. Особенно, когда мои сыны такие шебутные… Спасибо от всей Души!!!

Татьяна С., Подольск

 

Я поняла, что это просто везение, что я узнала про этот Курс «Кубики Зайцева»

Меня зовут Ирина. Я с удовольствием водила ребенка на занятия к Ольге Витальевне «Зайки — Читайки». Мне было интересно наблюдать, как раз от раза он все больше набирался смелости и уверенности в прочтении сначала кубиков, потом таблиц. А когда он стал сам составлять слова по карточкам без помощи, я поняла, что это просто ВЕЗЕНИЕ, что я узнала про этот Курс занятий и привела сюда своего Сеню!

Огромная благодарность Ольге Витальевне за ее чуткость к детям и интересный подход в подаче знаний.

 

Ольга дала рекомендации… Всё было просто и понятно… Развеялись страхи.

Вчера получила консультацию Ольги по поводу плохо говорящей 3х-летней дочки.

За короткое время и дистанционно удалось выяснить, в чём конкретно состоит проблема, где пробел в обучении речи ребёнка, на что нам стоит обратить внимание (касаемо психологических моментов ЗРР).

Ольга дала рекомендации о занятиях: что делать сейчас, что потом. Всё было просто и понятно. Развеялись страхи. Приятная и полезная консультация! Спасибо!

Ольга Поросная

 

Есть люди, встреча с которыми оставляет след на всю жизнь…

Есть люди, встреча с которыми оставляет след на всю жизнь! Таким человеком для меня и моей внучки Дианы стала ОЛЬГА ВИТАЛЬЕВНА, которая проводила музыкальные занятия в детском садике.

Именно от внучки я каждый день слышала радостные отзывы о занятиях, видела, с каким нетерпением ждёт она следующей встречи с любимым педагогом!

Ольга Витальевна добрый и чуткий человек, умеющий найти подход к разным детям, вселить в них уверенность, открыть в каждом скрытые таланты. Тщательно подобранный репертуар, красивые мелодии, владение инструментом — всё это пробуждает детские души, делает их чуткими…

Спасибо Ольге Витальевне за подаренную радость!

 

С первых минут общения Ольга расположила к себе…

Недавно, по волшебному стечению обстоятельств, я попала на бесплатную консультацию по Скайпу с Ольгой Енковой.

С первых минут общения Ольга расположила к себе, сразу стало ясно, что это добрый, открытый, мягкий человек с которым просто тянуло общаться, как будь то мы старые знакомые и давно не виделись.

Ольга внимательно выслушала мои вопросы по поводу речи и поведения моей дочки и очень профессионально дала рекомендации и ссылки на сайты, которые могут мне пригодиться.

Спасибо вам огромное, Ольга! Очень благодарна за интересную беседу и ваши рекомендации. Желаю вам успехов и всех благ в вашей интересной работе с нашими прекрасными, маленькими ангелочками).

Наталья Королева, г. Иваново.

 

 

Homescapes – прохождение всех уровней. Как пройти уровни Homescapes — Поиграем? — Блоги

Все секреты головоломки про Остина.

Homescapes – игра «три в ряд» от Playrix. Некоторые уровни головоломки о дворецком Остине действительно сложны – мы сделали гайд про прохождение игры Homescapes. В гайде собраны секреты Homescapes и подсказки, а также информация о том, как пройти уровни Homescapes.

Земфира выпустила клип про дворецкого из Homescapes

Homescapes уровень 11 – прохождение

Нужно добыть 60 шт. лампочек и 58 шт. частей ковра. Свободных ходов на это – 26. Первый ход будет таким: сдвиньте кружки зеленого цвета в верхней правой части поля, чтобы Остин получил ракету. Не тратьте ее сразу, попытайтесь поставить другие фишки по 3-5 в ряд, накопите бонусы (бомбы, самолеты).   

Homescapes уровень 24 – прохождение

Нужно собрать 40 шт. желтых лампочек и 40 шт. синих книжек. Количество ходов – 22. Следите за игрой и старайтесь выбивать максимальные комбинации с большим количеством предметов в рядах -4 или 5. Получите бомбы и ракеты, соберите все предметы.

Homescapes уровень 28 – прохождение

Прохождение уровней Homescapes

Соберите пончики и ковер за 25 ходов. Та же стратегия, что и на уровне 24. Выбивайте максимальные комбо для получения ракет, бомб, самолетов и других бонусов. 

Промокоды на Genshin Impact

Homescapes уровень 37 – прохождение

Добудьте 51 коврик и 6 плюшек. Видеогайд поможет пройти этот хитрый уровень, но ваше поле может отличаться от представленного в ролике. 

Homescapes уровень 42 – прохождение

В этом уровне тоже меняется поле. Ознакомьтесь с прохождением в видео. 

Homescapes уровень 45 – прохождение

Один из сложнейших уровней Homescapes. Соберите 20 яблок за 14 ходов. В первую очередь уничтожьте цепи, мешающие сбору яблок.

Homescapes уровень 47 – прохождение

Прохождение сложных уровней

Соберите 40 шт. печенья и постелите ковер на 59 клеточках. У вас на это 30 ходов. Начните с ковра, но параллельно собирайте печенье. С помощью комбо выбивайте бомбы и ракеты. Взрывайте предметы, расположенные на коврике, чтобы занять больше клеток.

Homescapes уровень 54 – прохождение

Соберите 17 вишен и 16 яблок за 32 хода. Поле нестандартной формы. Разрушьте цепи в центре поля – так вы быстро получите доступ к яблокам и избавитесь от вишен в центре. Далее займитесь вишнями по краям уровня. Попробуйте сделать бомбу, чтобы быстрее разрушить предметы, ракеты используйте на фишках со льдом – так вы достанете спрятанную вишню. 

Homescapes уровень 67 – прохождение

Получите 38 вишен за 32 хода. Создайте бомбы и ракеты на втором поле. С помощью синих фишек на первом поле сделайте самолет.

Homescapes уровень 80 – прохождение

Застелите 87 клеток уровня ковром. Для этого уничтожьте все лишнее. Начните с синих фишек в нижней части уровня и сделайте ракету. Зеленые чашки тоже пригодятся для создания ракет. С помощью ракеты расставьте чашки в радужный шар.

Промокоды на Standoff 2 2021

Homescapes уровень 86 – прохождение

Переместите вниз 4 пончика за 25 ходов. Все пончики появятся одновременно, но в разных местах. Сломайте коробки (снизу и в центре) и доберитесь до пончиков. Используйте бомбы, радужный шар и другие бонусы.

Homescapes уровень 89 – прохождение

За 21 ход наберите 14 вишен за 21 ход. Перемещать предметы через перегородки не получится, доставайте вишню из льда. Собирайте вишни при помощи ракет, а бомбами взрывайте перегородки и ледяные клетки. Попробуйте объединить самолет или бомбу с радужным шариком и получите множество бонусов.

Homescapes уровень 100 – прохождение

Переместите вниз 6 пончиков за 29 ходов. Уничтожьте пену бомбой или ракетой, объедините радужный шарик с бонусом.

Homescapes уровень 133 – прохождение

Опустите 7 пончиков за 31 ход. Разрушьте коробки на обеих досках. Заледеневшие ячейки откроются только при использовании бонусов. Все пончики на первом поле будут расположены в одной колонке, просто уничтожьте два ряда. Протащите пончики вниз, освободив поле и применив бонусы. На второй доске передвиньте пончики в нижнюю область ряда.

Homescapes уровень 134 – прохождение

Соберите 27 вишенок и расстелите ковер на 56 клетках. У вас на это 30 ходов. Используйте два радужных шарика с умом: взорвите их в самом низу. Расчистите путь для шариков с помощью ракет, скомбинируйте бонусы – так почти на всем поле появится ковер. Соберите вишенки и расстелите ковер на оставшихся ячейках.

* * *

Скачать Homescapes бесплатно iOS и Андроид

Земфира выпустила клип про дворецкого из Homescapes

Радужная мышь с раком для визуализации функциональной геномики онкогенной клональной экспансии

Разработка и проверка моделей радуги мыши с раком

Crainbow — это система генетических моделей для маркировки и визуализации отдельных клеток, которые экспрессируют соматические мутации. В трансген Crainbow включены четыре положения, которые либо экспрессируют инертный флуоресцентный белок (положение 0), либо три спектрально разрешимых флуоресцентных белка в паре с выбранной онкогенной мутацией (положения 1–3).Кроме того, эти гены-кандидаты-драйверы сливаются с уникальными эпитопами, чтобы гарантировать, что полученные ими белковые продукты могут быть иммунолокализованы в ткани. Таким образом, простая активация с помощью Cre-рекомбиназы может индуцировать пространственно-временную экспрессию флуоресцентно штрих-кодированных генов-драйверов опухоли и одноклеточную визуализацию приспособленности клеток, передачи сигналов клеток и клонального распространения онкогенных мутаций (рис. 1b). В этом отчете было сделано несколько изменений, чтобы преодолеть предыдущие ограничения в области проектирования и визуализации ²¹ .Во-первых, был использован беспрепятственный и эффективный подход клонирования для создания целевых векторов Crainbow ^21,22,23,24 (рис. 1c). Во-вторых, была оптимизирована палитра флуоресцентного белка (XFP) для визуализации in vivo и ex vivo. Эта оптимизация включала использование химически индуцируемого флуоресцентного белка ближнего инфракрасного диапазона (FAP-Mars1 ²¹ ) для смягчения избыточного контрольного сигнала ²⁰ , нацеливания XFP на ядро ​​для подсчета клеток и доставки двух отдельных векторных систем с разными Палитры XFP (дополнительные рис.1–3). В-третьих, экспрессия трансгена была увеличена за счет включения посттранскрипционного регуляторного элемента гепатита сурка (WPRE) ²⁵ . В-четвертых, позиционное смещение, присущее системам Cre / LoxP, было эмпирически определено на контрольной мыши. В этом исследовании были разработаны три модели мышей Crainbow, которые суммированы в таблице 1.

Таблица 1 Обзор линий мышей радуги (Crainbow).

Контрольная мышь Crainbow была разработана для проверки экспрессии трансгена и расчета позиционного смещения.Модель контрольной мыши NCAT Crainbow ( N — усеченный на конце аллель ß енина кошки ) кодирует ту же усеченную на N-конце и онкогенную форму ßкатенина (ΔNßcat ) в каждой позиции ²⁶ . Каждый ΔNßcat коэкспрессируется с TagBFP, mTFP1 или mKO (рис. 2а, дополнительный рис. 4). Простая конфокальная визуализация для каждого маркера происхождения флуоресцентных белков может использоваться для оценки позиционного смещения, вызванного рекомбинацией, и клонального распространения онкогенных мутаций. NCAT Crainbow мышей скрещивали с мышами, экспрессирующими рекомбиназу Villin-Cre , с получением NCAT ( +/- ): VilCre ( +/- ) мышей ( NCAT ^VilCre ) и тем самым индуцируют рекомбинацию Crainbow в развивающемся кишечном эпителии ( e12.5 ) ²⁷ . NCAT ^VilCre мышей умерщвляли между 9-20 постнатальными днями (PND) и визуализировали кишечник с помощью конфокальной микроскопии.Поскольку TagBFP подавлялся после фиксации, визуализацию по возможности выполняли на свежеизолированной ткани. Комплексные препараты NCAT ^VilCre кишечника позволили получить конфокальную визуализацию через серозную оболочку и в кишечную крипту (рис. 2b). Крипты кишечника содержат популяцию ISC, которые симметрично делятся и стохастически дифференцируются. Это приводит к нейтральному дрейфу ISC и крипт, которые заселяются одним клоном стволовых клеток — процесс, также известный как фиксация крипт ^28,29 .Конфокальная визуализация кишечных крипт показала, что фиксация крипт уже произошла в большинстве крипт к моменту анализа, о чем свидетельствуют моноклональные крипты, которые экспрессировали TagBFP (голубой), mTFP1 (желтый) или mKO (пурпурный) (рис. 2b, c) . Несмещенная рекомбинация Crainbow должна приводить к 1/3 шанса активации положений 1, 2 или 3. Таким образом, крипты XFP были подсчитаны и нормализованы к этой ожидаемой вероятности 0,33 для расчета смещения рекомбинации. Значения, равные 1, не отражают смещения, тогда как> 1 смещено положительно, а <1 - отрицательно.Активация Крейнбоу имеет 2,3-кратное положительное смещение для положения 1 и сопутствующее отрицательное смещение, аналогичное для положений 2 и 3 (рис. 2d). Мышей NCAT также скрещивали с мышами ROSA-Cre ^{ER / T2} для получения NCAT (+/-): ROSACre ^{ER / T2} (+/-) мышей ( NCAT ^{CreER / T2} ) и обрабатывали тамоксифеном для оценки позиционного смещения у взрослых мышей. NCAT ^{CreER / T2} были умерщвлены через 12 дней после инъекции тамоксифена, чтобы обеспечить ISC-мечение и клональную замену дифференцированного клеточного клона.Как и ожидалось, полосы из рекомбинированных эпителиальных клеток TagBFP, mTFP1 и mKO, исходящие из основания крипты, наблюдались с помощью конфокальной микроскопии тонкой кишки, разрезанной вибратомом (Fig. 2e, f). Количественная оценка смещения рекомбинации выявила положительное смещение для положения 1 и отрицательное смещение для положений 2–3. Это смещение было похоже на смещение, наблюдаемое в исследованиях развития NCAT ^VilCre (рис. 2g). Исследования NCAT предоставили основу для визуализации клонального распространения онкогенов в кишечнике с использованием моделей мышей Crainbow.

Рис. 2

Проверка функциональности Crainbow. a Схема мышей NCAT-Crainbow . См. Также Таблицу 1 и Дополнительный Рис. 1. b NCAT ^{VilCre Тонкая кишка} ( N = 10 мышей, PND9 – PND20) была подготовлена ​​как цельное и конфокальное изображение для экспрессии XFP в кишечные крипты. c Вставка в « b » при большем увеличении. d Крипты сегментировали по цвету и подсчитывали.Экспериментально наблюдаемое значение было нормализовано к предсказанному стохастическому результату (0,33 / XFP). Звездочка обозначает статистическую значимость одностороннего дисперсионного анализа (TagBFP против mTFP1: p <1e – 6, TagBFP против mKO: p <1e – 6, mTFP1 против mKO: не значимо). Мышам NCAT ^{CreER / T2} ( N = 8, возраст 19–22 недели) вводили 200 мг / кг тамоксифена. Мышей умерщвляли через 12 дней после инъекции тамоксифена, тонкую кишку делали вибратомом и окрашивали антителами для восстановления подавленного сигнала TagBFP. и Срезы были визуализированы с помощью конфокальной микроскопии на предмет экспрессии XFP (TagBFP: голубой, EYFP: mTFP1, mKO: пурпурный; показаны сегментированные ядерные маски, наложенные поверх визуализированного контура ткани). f Повернутая вставка в « e » при увеличенном увеличении. г Ядра были сегментированы, подсчитаны и нормализованы до предсказанного стохастического результата (0,33 / XFP). Звездочка обозначает статистическую значимость одностороннего дисперсионного анализа (TagBFP vs. mTFP1: p <1e – 6, TagBFP vs.mKO: p <1e – 6, mTFP1 по сравнению с mKO: 8.4e – 4). (SEM включен для каждого графика). Масштабные полосы = 100 мкм для b, c, f и 2 мм для e . Исходные данные представлены в виде «файла исходных данных».

Рост кишечника ускоряет клональное распространение онкогенов

Генетическая инактивация аденоматозного полипоза кишечной палочки ( APC ) усиливает передачу сигналов Wnt и является известным драйвером рака толстой кишки ^30,31,32 . Бета-катенин является последующим сигнальным эффектором и главным кандидатом для увеличения пригодности стволовых клеток и инициации полевого рака.Несколько изоформ ßcatenin ранее использовались для изучения передачи сигналов Wnt. ΔNßcat уже описан выше у мышей NCAT и усиливает передачу сигналов Wnt, избегая деградации. Изоформа Ccat / Lef1 представляет собой слияние С-концевого домена трансактивации ßcat с фактором транскрипции Lef1. Ccat / Lef1 усиливает передачу сигналов Wnt, но не может секвестрироваться эпителиальным кадгерином (CDh2) ^33,34 . ∆Nβcat∆C лишен N-концевого домена ßcat и избегает деградации, но также лишен C-концевого домена трансактивации и, таким образом, неспособен передавать ядерную передачу сигналов Wnt ^33,34,35 .Эти соматические мутации различаются по своей способности передавать сигналы Wnt и являются отличными прототипами для подтверждения Crainbow как надежной системы, которая количественно определяет клональную экспансию онкогенов in vivo. Поэтому была создана модель мыши MCAT-Crainbow (конечные формы ß M ß cat , рис. 3а и дополнительные рис. 3, 5). MCAT также использовала палитру mTFP1, EYFP и mKO для более благоприятного конфокального изображения.

Рис. 3

Широкое распространение онкогенных клонов во время перинатального развития. a Схема мышей MCAT-Crainbow . См. Также Таблицу 1 и Дополнительный Рис. 5. b MCAT ^VilCre Тонкий кишечник ( N = 10 мышей, возраст 3–6 недель), подготовленный как цельный и конфокальный. c Вставка в « b » при большем увеличении. d MCAT ^VilCre Крипты были сегментированы по цвету, подсчитаны и нормализованы к позиционному смещению, рассчитанному на мышах NCAT ^VilCre .Звездочка обозначает статистическую значимость одностороннего дисперсионного анализа (mTFP1 по сравнению с EYFP: p = 0,003, mTFP1 по сравнению с mKO: p = 0,016, EYFP по сравнению с mKO = 3e – 6). e Иммуноокрашивание на эпитопы FLAG, V5 или HA (пурпурный), специфичных для каждой изоформы ßcat в срезах тонкого кишечника MCAT ^VilCre и слитых с флуоресцентными маркерами происхождения (mTFP1: голубой, EYFP: желтый и mKO: оранжевый). Стрелки обозначают экспрессию изоформы с помощью репортера родственной линии (FLAG и mTFP1, V5 и EYFP, а также HA и mKO).Соответствующие вставки изображают изображения с большим увеличением. Стрелки обозначают ßcat, локализованные в мембране, тогда как звездочка обозначает ßcat, локализованные в ядре. Пятна эпитопа (пурпурный) также представлены как объединенные и как одноканальное изображение с его родственным флуоресцентным репортером клонов (зеленый). f НЕК-клетки временно трансфицировали изоформами MCAT, фиксировали, окрашивали и визуализировали для указанного эпитопа (пурпурный) и флуоресцентного репортера (зеленый). Клетки также котрансфицировали эпителиальным кадгерином ( CDh2 ), как указано.Стрелки обозначают секвестрацию ßcat плазматической мембраной, а звездочка обозначает ядерную ßcat. г, активность передачи сигнала Wnt для каждого онкогена в отсутствие CDh2 (сплошная полоса) или в присутствии сверхэкспрессированного CDh2 (заштрихованная полоса) ( N = 6 лунок на условие и независимо повторены в четырех экспериментах). Активность TOP FLASH нормализовали для контрольных клеток, стимулированных WNT / RSPO (пунктирная линия). Звездочка обозначает статистическую значимость двустороннего дисперсионного анализа и теста множественных сравнений Бонферрони (голубой <1e – 6, желтый = 0.01, пурпурный = 0,02). (SEM включен для каждого графика). Масштабные линейки = 1 мм для b , 100 мкм для c / e , 15 мкм для e: вставок 1–3 и 10 мкм для f . Исходные данные представлены в виде «файла исходных данных».

MCAT Мышей Crainbow скрещивали с мышами, экспрессирующими рекомбиназу Villin-Cre , чтобы получить мышей MCAT (+/-): VilCre (+/-) ( MCAT ^VilCre ) и тем самым индуцировать рекомбинация Crainbow в развивающемся кишечном эпителии ( e12.5 ) ²⁷ . Конфокальная визуализация всего 3–6-недельного тонкого кишечника MCAT ^VilCre показала, что фиксация крипты уже произошла, о чем свидетельствует один цвет эпителиальных клеток в каждой крипте (рис. 3b, c). ). Распространение онкогенных клонов по кишечнику также изучали на мышах MCAT. Тот же аллель ΔNßcat использовали в позиции 1 мышей NCAT и MCAT . Следовательно, относительный потенциал распространения клонов был рассчитан путем нормализации частоты крипт MCAT к смещению позиционной рекомбинации, рассчитанному на мышах NCAT ^VilCre . Ccat / Lef1 Экспрессия индуцировала относительное 1,6-кратное увеличение потенциала распространения клона. Напротив, ΔNβCatΔC индуцировал соответствующее 0,4-кратное снижение потенциала распространения клона, а ΔNβcat не изменился (фиг. 3d). От проксимальной до дистальной оси кишечника различается сигнальный потенциал Wnt / ßcatenin ³⁶ . Экспрессия ΔNßCatΔC привела к аналогичному снижению потенциала распространения клонов в толстой кишке, а эффекты Ccat / Lef1 были смягчены и больше похожи на ΔNßcat (дополнительный рис.6а, б).

Эпителиальный кадгерин (CDh2) секвестрирует βcat на боковой плазматической мембране, действуя как молекулярный «сток» для избытка βcat, который в конечном итоге ингибирует передачу сигналов Wnt ^37,38 . Мы предположили, что повышенное распространение клонов Ccat / Lef1 было связано с потерей активности секвестрации CDh2. Окрашивание антителами для меток эпитопа, слитых с каждой изоформой βcat, показало, что каждая изоформа правильно экспрессировалась с родственным ей XFP (фиг. 3e, стрелки, ). Иммуноокрашивание FLAG для ΔNßcat и иммуноокрашивание HA для ΔNßCatΔC показало секвестрацию ßcat плазматической мембраной без детектируемого ядерного сигнала (рис.3e, наконечников стрел ). Напротив, иммуноокрашивание V5 на Ccat / Lef1 выявило ядерную локализацию без детектируемой экспрессии на плазматической мембране (фиг. 3e, звездочки ). Аналогичный эффект наблюдался в системе дополнительной трансфекции in vitro (рис. 3f). Кроме того, люминесцентный анализ TOP-FLASH для передачи сигналов Wnt ³⁹ продемонстрировал, что только Ccat / Lef1 может эффективно передавать передачу сигналов Wnt / ßcat в присутствии CDh2 (Fig. 3g). Эти результаты подтвердили, что моделирование Крэйнбоу можно использовать для индукции и прямого сравнения множественных предраковых эпителиальных клонов, несущих онкогенные мутации, и что эти клоны эффективно распространяются во время перинатального развития кишечника.

Мышей MCAT также использовали для изучения эволюции онкогенных клонов в кишечнике взрослых. Мышей MCAT скрещивали с мышами ROSA-Cre ^{ER / T2} для получения MCAT (+/-): ROSACre ^{ER / T2} (+/-) мышей ( MCAT ^{CreER / T2} ). Взрослых мышей MCAT ^{CreER / T2} лечили тамоксифеном 200 мг / кг и преследовали в течение 3 дней или 8 недель.Редкая рекомбинация наблюдалась по всему эпителию ворсинок и крипт на 3-й день (рис. 4а). Предыдущие исследования по отслеживанию клонов кишечного эпителия показали, что рекомбинированные эпителиальные клетки ворсинок теряются в течение нескольких дней и заменяются клонами эпителиальных клеток, происходящими из рекомбинированных ISC ²⁹ . Клоны рекомбинированных клеток MCAT можно было аналогичным образом наблюдать через 8 недель после рекомбинации, индуцированной тамоксифеном (фиг. 4b). Клоны были ограничены узкими полосами рекомбинированных эпителиальных клеток внутри каждой ворсинки и обычно имели ширину всего несколько клеток.Широкой рекомбинации всей ворсинки не наблюдалось. Оценку распространения клонов определяли путем подсчета общего количества рекомбинированных клеток на 3 день по сравнению с 8 неделями. Общее количество рекомбинированных клеток не увеличивалось с 3 дня до 8 недель ни для одной из онкогенных изоформ ßcat. Также наблюдалось очевидное, но статистически незначимое снижение общего количества рекомбинированных клеток Ccat / Lef1 (рис. 4c). Следовательно, распространение клонов в кишечнике взрослых MCAT не происходит значимо.

Рис. 4

Микросреда крипт препятствует распространению онкогенных клонов у взрослых. a , b MCAT ^{CreER / T2} мышей (возраст> 6 недель) получали I.P. инъецировали 200 мг / кг тамоксифена и умерщвляли через 3 дня ( N = 8) или 8 недель спустя ( N = 5). Тонкую кишку делали на разрезе с помощью вибратома и визуализировали. c Ядра были сегментированы, подсчитаны и нормализованы к общему объему визуализированной ткани.Распространение клонов определяли путем сравнения изменения общего количества рекомбинированных ядер для каждой судьбы на 3-й и 8-й день. Статистическая значимость путем моделирования смешанных эффектов и поправки на многократное сравнение Сидака (∆Nßcat: p = 0,99, Ccat / Lef: p = 0,14 ∆Nßcat∆C : p = 0,99). d , e MCAT ^{CreER / T2} (возраст> 6 недель) вводили трижды (дни 1, 3, 5) 200 мг / кг тамоксифена и умерщвляли на 7 день ( N = 4) или через 8 недель ( N = 5).Тонкую кишку получали изображение целиком с помощью конфокальной микроскопии. Обозначены типичные крипты, и f была измерена относительная доля событий фиксации крипт для каждой изоформы βcat. Статистическая значимость с помощью однофакторного дисперсионного анализа и критерия множественного сравнения Холма-Сидака (∆Nßcat против Ccat / Lef1: p = 0,011 (∆Nßcat против ∆Nßcat∆C : p = 0,0062, Ccat / Lef1 vs ∆Nβcat∆C p = 0,259) г MCAT ^VilCre крипт выделяли и культивировали, как в указанных средах (+/- ингибитор c59 при 10 нМ), а затем визуализировали с помощью конфокальной микроскопии. h Вид лунок с большим увеличением ( N = 6) для каждого состояния в « g » и соответствующие вставки с поворотом. i MCAT ^{VilCre Субкультивировали} органоидов (P0 – P5 и N = 5–10 лунок на субкультуру) и подсчитывали всю лунку, полученную с помощью конфокальной микроскопии, и органоиды каждой линии. Относительное распространение клонов для каждой судьбы органоидов рассчитывали путем нормализации к количеству крипт (C) при выделении (см.также дополнительный рис.6в). Звездочка обозначает статистическую значимость моделирования смешанных эффектов и post hoc Даннета относительно контроля Crypt (C) (∆Nßcat: p = 0,03, p = 0,002, p <0,0001 и Ccat / Lef1: p < 0,0001 для каждой звездочки и ∆Nßcat∆C p <0,0001 для каждой звездочки). j Эффективность образования органоидов для крипт MCAT, культивируемых в « г — ч ». Звездочка обозначает статистическую значимость двустороннего дисперсионного анализа и теста множественных сравнений Тьюки.Условия ENRY: не значимо между изоформами ßcat, тогда как Ccat / Lef1 значительно отличалось от ∆Nßcat и ∆Nßcat∆C для каждого лечения (ENRY + c59: p = 0,0003, ENY: p = 0,03 и ENY + c59 : p = 0,01). (SEM включен для каждого графика). Масштабные линейки = 200 мкм для a , b , 100 мкм для d , e , 2 мм для г и 200 мкм для h . Исходные данные представлены в виде «файла исходных данных».

Фиксация соматических мутаций в крипте является инициирующим событием в формировании поля рака.Предыдущий отчет документально подтвердил, что ISC с сильными соматическими мутациями все еще могут быть заменены соседними стволовыми клетками в крипте ¹⁰ . Таким образом, скорость фиксации крипт была измерена у мышей MCAT. MCAT ^{CreER / T2} Мышей трижды обрабатывали 200 мг / кг тамоксифена (дни 1, 3 и 5) для обильного мечения нескольких ISC в криптах. Мышей умерщвляли на 7 день или через 8 недель. Полная конфокальная визуализация кишечных крипт на 7-й день показала, что 42% крипт были помечены.Было очевидно множество примеров моноклональных, биклональных или триклональных крипт (рис. 4d). Предыдущие исследования по отслеживанию клонов показали, что фиксация крипт происходит в течение 4-8 недель ²⁹ . Конфокальная визуализация кишечных крипт MCAT через 8 недель после рекомбинации показала, что фиксация крипт произошла в 15% подсчитанных крипт (рис. 4e). Относительную долю фиксированных крипт для каждой линии MCAT рассчитывали через 8 недель и нормализовали на позиционное смещение, чтобы рассчитать относительный потенциал фиксации крипт каждой изоформы βcat.Результаты показали, что относительный потенциал фиксации ISC mTFP1: ΔNßcat был умеренно увеличен по сравнению со сниженным потенциалом фиксации EYFP: Ccat / Lef1 и mKO: ΔNßCatΔC ISC (рис. 4f). Прямое измерение распространения клонов и фиксации крипт у мышей MCAT показывает, что нормальный кишечник взрослого человека устойчив к клональной экспансии онкогенных мутаций.

Интересно, что эффективная и широко распространенная канцеризация поля во время разработки ранее приписывалась пластичности крипт во время разработки, включая деление крипт и образование зарождающихся крипт ¹⁴ .Культуры органоидов кишечника эффективно моделируют пластичность крипт ⁴⁰ . Таким образом, органоиды MCAT использовались как коррелят ex vivo клональной экспансии онкогенов, наблюдаемой во время развития. Крипты, экспрессирующие ΔNßcat-, Ccat / Lef1 -, ΔNßCatΔC- , были выделены из мышей MCAT ^VilCre и аналогичным образом установлены жизнеспособные органоиды в полной среде (рис. 4g, h, панель 1). Органоиды MCAT были пассированы таким образом, чтобы каждая линия могла быть продольно изучена на предмет изменений конкурентоспособности с течением времени.Интересно, что органоиды, экспрессирующие CCat / Lef1 , быстро увеличивались после нескольких раундов субкультивирования, тогда как органоиды, экспрессирующие ΔNßcat и ΔNßCatΔC , не увеличивались (рис. 4i и дополнительный рис. 6c). Клетки Панета являются источником Wnts в культуре органоидов и необходимы для роста органоидов ⁴¹ . Органоиды обрабатывали c59 для предотвращения ацилирования Wnt и тем самым ингибирования секреции Wnt ⁴² . Только органоиды, экспрессирующие Ccat / Lef1, росли в отсутствие Wnt (рис.4g, h, j, Панель 2). Точно так же органоиды нуждаются в экзогенных Rspondins (RSPO) для своего роста ⁴³ . Только органоиды Ccat / Lef1 могли расти без Rspondin (фиг. 4g, h, j, , панель 3). Органоиды Ccat / Lef1 также могли расти в отсутствие Wnts и RSPO (фиг. 4g, h, j, , панель 4). Следовательно, онкогенная активация передачи сигналов Wnt / ßcat наделяет ISC повышенной приспособленностью, что приводит к их преимущественной экспансии в течение разрешающего периода развития кишечника, но не в кишечнике здорового взрослого человека.

Быстрое распространение онкогенов в кишечнике взрослого человека за счет онкогенеза микроокружающей среды

Обильное деление крипт и образование зарождающихся крипт в органоидах, вероятно, частично связано с искусственным восстановлением микросреды, в которой выращиваются клетки, включая важные факторы ниши как (RSPO) s ^41,43 . RSPO3 является критическим регулятором кишечного микроокружения ¹⁶ , и in vivo его экспрессия обычно ограничивается субэпителиальной мезенхимой кишечника WT (рис.5а). Слияния RSPO3 с PTPRK были обнаружены у пациентов с раком толстой кишки ¹⁷ и являются протуморигенными у мышей ¹⁸ . Поэтому модель Crainbow RSPO3 была создана для проверки гипотезы о том, что неправильная экспрессия RSPO3 и его продуктов слияния нарушает микросреду крипты и вызывает распространение онкогенных клонов за счет увеличения деления крипты. ROBO Мыши Crainbow ( R SP O 3-Crain bo w) кодируют RSPO3, PTPRK ^e1 : RSPO3 ^e2–5 и PTPRK ^e1–7 : RSPO3 ^e2–5 в положениях 1–3 Crainbow и коэкспрессируются со штрих-кодом флуоресцентного белка mTFP1, EYFP и mKO (рис.5b и дополнительный рис. 7).

Рис. 5

Эктопическая экспансия компартмента кишечных стволовых клеток за счет экспрессии онкогенного RSPO3. a Multiprobe RNA FISH и конфокальная микроскопия для Top2a (голубой), Lgr5 (желтый) и Rspo3 (пурпурный) в залитых парафином срезах тонкой кишки (SI) и толстой кишки (Col). b ROBO ^{VilCr e} мышей, экспрессирующих онкогенный человеческий RSPO3. Положение 0: контрольный и мембранно-ориентированный FAP-Mars1 , Положение 1: mTFP1 (голубой), коэкспрессируется с 3 × FLAG-RSPO3, EYFP (желтый), коэкспрессируется с V5-PTPRK ^e1 : RSPO3 ^e2–5 , и позиция 3 : mKO (пурпурный), коэкспрессируемая с 3 × HA-PTPRK ^e1–7 : RSPO3 ^e2–5 (см. также дополнительный рис.7). c Общий осмотр мышей ROBO ^VilCre и желудочно-кишечного тракта на PND16 по сравнению с контрольными однопометниками WT . WT и ROBO d тонкая кишка (SI) и e толстая кишка (Col) заливали парафином и делали срезы на патологию H&E и совместную диагностику маркеров указанного типа клеток с помощью мультизондовой РНК FISH. Изображения представляют собой вставки из целых слайдовых швейцарских рулетов (см. Дополнительные рис.8–13). f MCAT ^VilCre и ROBO ^VilCre мышам инъецировали EdU (пурпурный) и получали совместные изображения для каждой репортера линии с помощью конфокальной микроскопии (mTFP1: голубой, EYFP: желтый, mKO: оранжевый) . г ROBO ^VilCre органоидов могут расти без экзогенного RSPO3 (ENY) и были визуализированы с помощью конфокальной микроскопии для каждого репортера клонов. Масштабные линейки = 10 мкм для a , 2 см для c , 100 мкм для d, e , 50 мкм для f и 1 мм для g .Исходные данные представлены в виде «файла исходных данных».

ROBO Crainbow мышей скрещивали с мышами, экспрессирующими рекомбиназу Villin-Cre , чтобы получить ROBO (+/-): VilCre (+/-) мышей ( ROBO ^VilCre ) и тем самым вызвать рекомбинация Crainbow в развивающемся кишечном эпителии ( e12.5 ) ²⁷ . Получившиеся в результате щенки ROBO ^VilCre развили вздутие живота и к моменту отлучения от груди умерли.При макроанатомическом исследовании был выявлен расширенный и удлиненный тонкий и толстый кишечник по сравнению с мышами WT (рис. 5c). Полное изображение тонкого и толстого кишечника, окрашенного H&E, окрашенного гематоксилином и эозином WT и ROBO ^VilCre , показало расширение зоны крипт в тонком кишечнике, базальную гиперплазию крипт, архитектурные искажения и случайные абсцессы просвета крипт (Рис. 5d, Дополнительные Рис. 8–13). Точно так же крипты толстой кишки были расширены за счет гиперплазии базальных крипт и архитектурных искажений, включая ветвление и почкование крипт (рис.5e, дополнительные фиг. 8–13). РНК FISH использовали для молекулярного картирования компартмента стволовых клеток в кишечнике WT и ROBO ^VilCre . Наблюдалось сильное расширение компартмента стволовых клеток у мышей ROBO ^VilCre , которое включало переизбыток Lgr5 -положительных стволовых клеток и Top2 a-положительных временно амплифицирующих (ТА) клеток ⁴⁴ (Рис. 5г, д, дополнительные рисунки 8–13). Напротив, заметное снижение дифференцированных Alpi -положительных энтероцитов ⁴⁵ наблюдалось в кишечнике ROBO ^VilCre . Reg3b , недавно описанный маркер энтероцитов, прилегающих к крипте стволовых клеток ^45,46 , был обнаружен в рассеянных клетках, вставленных в зону ТА крипты и более зрелых энтероцитах ворсинки. Клетки, экспрессирующие Reg3b , также размножались в тонком кишечнике ROBO ^VilCre по сравнению с WT . В толстой кишке клетки, экспрессирующие Reg3b , встречались реже у мышей WT и ROBO ^VilCre (рис.5г, д, дополнительные фиг. 8–13). ROBO ^VilCre Кишечник также имел расширенную зону пролиферации и отличался от нормальной зоны пролиферации, обнаруженной в криптах кишечника MCAT ^VilCre (рис. 5f). ROBO ^VilCre органоиды также росли в отсутствие экзогенных RSPOs (рис. 5g). Эти данные подтверждают, что эктопическая сверхэкспрессия Rspondins может реструктурировать микроокружение кишечника, приводя к гиперплазии крипт и эктопической экспансии пролиферативных стволовых клеток по всему эпителию ^16,47 .Мы назвали этот процесс онкогенезом микросреды.

Предыдущие отчеты показали, что слияния RSPO3 и RSPO3: PTPRK являются протуморигенными у мышей, но отсутствие отслеживания клонов не позволяет полностью понять, как каждая форма белка влияет на динамику стволовых клеток ¹⁸ . Поэтому мы оценили клональность стволовых клеток и развитие клонов в тонком кишечнике ROBO ^VilCre и сравнили его с MCAT ^VilCre тонкой кишки.Конфокальная визуализация показала, что кишечник ROBO ^VilCre был значительно больше, чем кишечник соответствующего возраста MCAT ^VilCre (рис. 6а). При большем увеличении кишечник MCAT ^VilCre показал типичный рисунок одноцветных клонов в ворсинках, которые исходят из основания крипты кишечника. Напротив, мыши ROBO ^VilCre имели меньше крупных одноцветных клонов и вместо этого характеризовались меньшими клонами, в которых каждая линия была гетерогенно смешана по всей ворсинке и крипте (рис.6б). Это свидетельствует о том, что фиксация крипт подавлена ​​у мышей ROBO ^VilCre . Конфокальные крипты для визуализации всего монтировки показали, что крипты ROBO ^VilCre были явно поликлональными (рис. 6c). Это было прямым контрастом с моноклональностью и фиксацией крипт, очевидной в контроле MCAT ^VilCre крипт (рис. 6d). Примеры моноклональности (рис. 6д, вставки 1–3), биклональности (рис.6e, вставок 4–6) и триклональность (рис. 6e, вставок 7, 8) наблюдались в криптах ROBO ^VilCre . Кроме того, деление крипт и зарастание крипт можно было наблюдать в криптах ROBO ^VilCre с помощью конфокальной микроскопии и подтверждать гистопатологическую оценку (Рис. 6e, вставки 1-3). Фиксация крипт оценивалась в ROBO ^VilCre и сравнивалась с MCAT ^VilCre и контрольными мышами NCAT ^VilCre .Этот анализ показал, что 95% и 97% крипт были моноклональными у мышей MCAT ^VilCre и NCAT ^VilCre соответственно. Напротив, только 76% крипт были моноклональными или фиксированными у мышей ROBO ^VilCre (рис. 6f). Примерно 23% крипт были биклональными у мышей ROBO ^VilCre , тогда как только 5% и 3% крипт были биклональными у мышей MCAT ^{VilCr e} и NCAT ^VilCre мышей, соответственно.Триклональные крипты были обнаружены у 1% мышей ROBO ^VilCre , но не наблюдались у мышей MCAT ^VilCre или NCAT ^VilCre . Фиксация крипт также подавлялась в толстой кишке (рис. 6g, h). Эти данные продемонстрировали, что онкогенез в микросреде ингибирует нейтральное дрейфовое поведение ISC и снижает скорость фиксации крипт.

Рис. 6

Онкогенез в микросреде ослабляет фиксацию крипт. a Вибратомные поперечные срезы MCAT ^VilCre и ROBO ^VilCre тонкой кишки были конфокальными изображениями и мозаиками для каждого репортера клонов (PND17). b Более высокое увеличение областей, указанных в « a ». c Целостная конфокальная визуализация тонкого кишечника для каждого флуоресцентного репортера клонов у мышей ROBO ^VilCre . d Полное конфокальное изображение MCAT ^VilCre тонкого кишечника. e Указанные выноски (1–8) от « c » при большем увеличении. f Процент каждого крипт, которые являются моноклональными (фиксация крипт), биклональными или триклональными, был рассчитан для мышей NCAT ^VilCre ( N = 3 и 938 крипт), MCAT ^VilCre мышей ( N = 9 и 6006 крипт проанализировано на PND17) и ROBO ^VilCre мышей ( N = 6 и проанализировано 3557 крипт).(SEM включен для каждого графика). г Полное конфокальное изображение ROBO ^VilCre толстой кишки на PND18. h Область интереса в « g » при большем увеличении. Стрелками показаны примеры крипт, где фиксация не произошла. Масштабные линейки = 1 мм для a , 100 мкм для b / d, g, h , 200 мкм для c и 40 мкм для e . Исходные данные представлены в виде «файла исходных данных».

Затем динамику клонов и передачу сигналов оценивали с помощью секвенирования одноклеточной РНК (scRNAseq) обогащенной криптой ткани, выделенной из WT и ROBO ^VilCre тонкой кишки. t- Кластеризация SNE и визуализация данных scRNAseq выявили десять типов клеток. Двумя из этих типов клеток были фибробласты и иммунные клетки. Остальные восемь включают стволовые клетки, временно усиливающиеся клетки, секреторные клетки Панета и бокаловидные клетки, энтероэндокринные клетки и три популяции энтероцитов, которые могут быть качественно связаны с отдельными пространственными зонами внутри ворсинок ⁴⁶ (Рис. 7a, Дополнительный Рис. 14) . Удивительно, но общий фракционный вклад каждого типа клеток и состояния клеточного цикла существенно не изменился между криптами WT и ROBO (рис.7б, в). Передача сигналов также в значительной степени не пострадала, поскольку только 25 генов (23 гена в ТА-клетках и два гена в ENTb1) экспрессировались по-разному (дополнительные данные 4). Данные scRNAseq предполагают, что онкогенез в микроокружении внешне модифицирует компартмент стволовых клеток.

Рис. 7

Онкогенез в микроокружении приводит к появлению гетерогенных предраковых клонов у взрослых. a Отдельные клетки выделяли из PND16 WT и ROBO ^VilCre путем фракционирования для обогащения эпителия крипт.Визуализацию scRNAseq и t SNE проводили для клеток WT и ROBO ^VilCre . (SC: стволовые клетки, TA: временно усиливающиеся клетки, ENT: энтероциты, которые включают нижнюю (b1: фазу S / G2M и b2: G1), среднюю (m) и верхнюю (t), и недавно были описаны ⁴⁵ , SECR: секреторные клетки Панета и Гоблета, IMMU: иммунные, ENTEND: энтероэндокринные, FIBR: фибробласты). Для маркеров типов клеток см. Также дополнительный рис. 14. b Визуализация тепловой карты типов клеток, присутствующих в изолятах WT и ROBO ^VilCre , в процентах от общего числа клеток. c Визуализация тепловой карты фазы клеточного цикла в процентах от каждого типа клеток. d — г ROBO ^{CreER / T2} ( N = 9 мышей в возрасте 6–15 недель) были I.P. инъецировали 200 мг / кг тамоксифена и умерщвляли через 3 дня ( N = 4) или 8 недель спустя ( N = 5), тонкую кишку делали вибратомом и визуализировали с помощью конфокальной микроскопии. Конфокальные изображения вибратомных срезов тонкого кишечника ROBO ^{CreER / T2} на d через 3 дня или e через 8 недель после инъекции тамоксифена. f Ядра сегментировали, подсчитывали и нормализовали до общего отображаемого объема. Распространение клонов определяли путем сравнения общего количества рекомбинированных ядер для каждой судьбы на 8-й неделе по сравнению с 3-м днем. Звездочка обозначает статистическую значимость, полученную при моделировании смешанных эффектов и поправке на множественное сравнение Сидака ( RSPO3 : <0,000001, PTPRK ^e1 : RSPO3 ^e2–5 (P1: R2-5): p = 0,31 и PTPRK ^e1–7 : RSPO3 ^e2–5 (P1-7 : R2-5): p = 0.94). г Доказательства ослабленной фиксации крипт через 8 недель после инъекции тамоксифена, как показали химерные крипты на конфокальной визуализации в целом. (SEM включен для каждого графика). Масштабные линейки = 100 мкм в d , e , g . Исходные данные представлены в виде «файла исходных данных».

Наконец, мы предположили, что онкогенез в микросреде может способствовать распространению онкогенных клонов в кишечнике взрослого человека. Чтобы проверить это, мышей ROBO скрещивали с мышами ROSA-Cre ^{ER / T2} для получения мышей ROBO (+/-): ROSACre ^{ER / T2} (+/-) мышей.Полученным мышам ROBO ^{CreER / T2} вводили однократную дозу тамоксифена и преследовали в течение 3 дней или 8 недель. На слизистой оболочке тонкого и толстого кишечника были обнаружены крипты с дисплазией отделения ISC через 8 недель (дополнительный рисунок 15). Конфокальная визуализация каждой клона продемонстрировала, что имела место спорадическая рекомбинация по всему эпителию крипты и ворсинок на 3 день ( Fig. 7d ) . Мы обнаружили, что через 8 недель рекомбинированные клетки распространились по эпителию кишечника ROBO ^{CreER / T2} и, следовательно, больше не были привязаны к локальному клону в отдельных криптах (рис.7д). Это резко контрастировало с аналогичными экспериментами, проведенными на мышах MCAT ^{CreER / T2} (рис. 4a – c). Мы количественно оценили распространение клонов, подсчитав общее количество рекомбинированных клеток на 3-й и 8-й день. Результаты показали, что онкогенные клоны значительно распространились у мышей ROBO ^{CreER / T2} . В частности, клонов WT RSPO3 увеличились в 6,7 раза, а PTPRK ^e1 : RSPO3 ^e2–5 клонов увеличились на 1.В 55 раз, тогда как ПТПРК ^e1–7 : RSPO3 ^2–5 клонов уменьшилось в 0,55 раза (рис. 7е). Кроме того, полученные крипты и клоны были гетерогенными, что подтверждает, что нейтральный дрейф и фиксация крипт также нарушены у взрослых (рис. 7g). Вместе наши данные показывают, что онкогенез в микросреде может индуцировать и быстро распространять гетерогенные онкогенные клоны в кишечнике взрослого человека за счет увеличения деления крипт, расширения компартмента стволовых клеток и ингибирования фиксации крипт.

Новый метод обнажает структуры внутри «радуги» клеток мозга | Spectrum

Молекулы альпак могут позволить ученым идентифицировать типы клеток в головном мозге, а также раскрывать их внутренние структуры ¹ . Этот метод может помочь исследователям лучше понять, как устроен мозг при аутизме.

Исследователи часто окрашивают ткани флуоресцентными антителами к определенным белкам, чтобы определить типы клеток. Они также могут использовать электронную микроскопию для изучения внутренней структуры ткани.

Но эти две техники нельзя использовать на одном и том же образце. В первом случае требуются химические вещества, которые часто разрушают клетки. Электронная микроскопия включает в себя тонкие срезы образца, и последующее окрашивание многочисленных срезов является чрезмерно трудоемким.

Ученые сконструировали клетки мозга для производства флуоресцентных белков или сделали метки, которые можно увидеть в электронный микроскоп. Но эти методы позволяют маркировать только три типа клеток на образец. Новый метод позволяет исследователям маркировать ткань до 10 маркеров.

Исследователи окрашивали срезы мозга мыши с помощью флуоресцентных «нанотел» — фрагментов антител, обычно получаемых от верблюдовых, семейства млекопитающих, которое включает верблюдов, альпак и лам. (Нанотела, которые они использовали, пришли из альпак.) Из-за своего небольшого размера нанотела могут проникать в ткань без предварительной обработки агрессивными химикатами.

Детали на глубине: Это окрашенное трехмерное изображение ткани мозга мыши показывает ветвящуюся микроглию (желтый), внедренную в матрицу из астроцитов (красный), кровеносных сосудов (зеленый) и ядер клеток (белый).

Снимок ячейки с:

Команда создала изображения окрашенной ткани с помощью флуоресцентного микроскопа. Затем они разрезали образцы на сегменты толщиной 50 нанометров и сканировали их с помощью электронного микроскопа. Используя компьютерное программное обеспечение, они выровняли оба набора изображений на основе таких ориентиров, как кровеносные сосуды.

Полученные изображения выделяют четыре типа клеток, в том числе звездообразные опорные клетки, называемые астроцитами, и иммунные клетки, называемые микроглией, каждый из которых помечен разными цветами.Флуоресцентные нанотела проникают более чем на 100 микрометров в блок ткани. В отличие от этого маркеры антител окрашивают только поверхность.

На изображениях показаны такие органеллы, как митохондрии (продуценты энергии клетки) и пучки микротрубочек (структурный скелет клетки). Исследователи также смогли различить длинные волокна, отходящие от нейронов, и везикулы на их концах, которые содержат химические посланники.

Метод нанотел может выявить различия в клеточной структуре и распределении типов клеток в мозге аутизма, говорит ведущий исследователь Джефф Лихтман, профессор молекулярной и клеточной биологии Гарвардского университета.Его команда описала эту технику в ноябре в Nature Methods .

Конечная цель, по словам Лихтмана, состоит в том, чтобы окрасить образец сотнями цветов путем разработки большего количества нанотел и комбинирования флуоресцентных красителей.

Разработка и характеристика клеточной линии печени радужной форели, экспрессирующей цитохром Р450-зависимую монооксигеназную активность

BABICH, H., and BORENFREUND, E. (1991). «Анализы цитотоксичности и генотоксичности с культивированными клетками рыб: обзор.«Токсикол. in Vitro 5: 91–100.

Google ученый

BABICH, H., MARTIN-ALGUACIL, N., and BORENFREUND, E. (1989). «Использование клеточной линии гепатомы радужной форели RTH-149 в анализе цитотоксичности». ATLA 17: 67–71.

Google ученый

BABICH, H., ROSENBERG, D.W., and BORENFREUND, E. (1991). «Исследования циктоксичности in vitro на клеточной линии гепатомы рыб, PLHC-1 ( Peeciliopsis lucida ).«Экотоксикол. Environ. Безопасность 21: 327–336.

Google ученый

BAYAD, J., BARGEL, D., SABOLOVIC, N., MAGDALOU, J., and SIEST, G. (1991). «Экспрессия и регуляция ферментов метаболизма лекарств в иммортализованной клеточной линии гепатоцитов крысы». Биохим. Pharmacol. 42: 1345–1351.

Google ученый

BECHTEL, D.G., and LEE, L.E.J. (1993). «RTL-W1: линия клеток печени радужной форели для изучения водных токсикантов, требующих метаболической активации.Бык. Может. Soc. Zool. 24 (2): 34.

Google ученый

BISGAARD, H.C., and THORGEIRSSON, S.S. (1991). «Доказательства общего происхождения примитивных эпителиальных клеток, выделенных из печени и поджелудочной железы крыс». J. Cell. Physiol. 147: 333–343.

Google ученый

BLAIR, J.B., MILER, M.R., PACK, D., BARNES, R., TEH, S.J. и HINTON, D.E. (1990). «Изолированные клетки печени форели: создание краткосрочных первичных культур, демонстрирующих межклеточные взаимодействия.”In vitro Cell. Dev. Биол. 26: 237–249.

Google ученый

BOLS, N.C., and LEE, L.E.J. (1991). «Технология и использование клеточных культур из тканей и органов костных рыб». Цитотехнология 6: 163–187.

Google ученый

BOLS, N.C., MOSSER, D.D., and STEELS, G.B. (1992). «Температурные исследования и последние достижения в области рыбных клеток in vitro». Комп. Биохим.Physiol. 103A: 1–14.

Google ученый

BORENFREUND, E., HGGINS, P.J., STEINGLASS, M., and BENDICH, A. (1975). «Свойства и злокачественная трансформация установленных паренхиматозных клеток печени крыс в культурах». J. Natl. Cancer Inst. 55: 375–384.

Google ученый

БОРОЕВИЧ, Р., МОНТЕЙРО, А.Н.А., ВИНХАС, С.А., ДОМОНТ, Г.Б., МУРАО, П.А.С., ЭМОНАР, Х., ГРИМАЛЬДИ Г., ГРИМАУ Д. (1985). «Создание непрерывной клеточной линии из фиброзных шистосомных гранулем в печени мышей». In Vitrol Cell. Dev. Биол. 21: 382–390.

Google ученый

BUCHMANN, A., KUHLMANN, W., SCHWARZ, M., KUNZ, C.R., MOLL, E., FRIEDBERG, T., and OESCH, F. (1985). «Регулирование и экспрессия четырех изоферментов цитохрома Р-450 НАДФН-цитохром Р-450 редуктазы, глутатионинтрансферазы В и С и микросомальной эпоксидгидролазы в пренеопластических и неопластических поражениях в печени крыс.Канцерогенез 6: 513–521.

Google ученый

CHEN, T.R. (1977). «Выявление in situ контаминации микоплазмой в клеточных культурах с помощью флуоресцентного красителя Hoescht 33258». Exp. Cell Res. 104: 255–262.

Google ученый

CLEMONS, J.H., VAN DEN HEUVEL, M.K., DIXON, D.G., and BOLS, N.C. (1992). «Факторы токсичного эквивалента для выбранных конгенеров ПХДДС, ПХДФ и ПХД с использованием клеточной линии печени радужной форели (RTL-W1).”Тринадцатое ежегодное собрание Общества токсикологии и химии окружающей среды, Реферат № TA6F40.

COLLODI, P., KAMEI, Y., ERNST, T., MIRANDA, C., BUHLER, D.R., and BARNES, D.W. (1992). «Культура клеток из эмбрионов рыбок данио ( Brachydanio rerio ) и взрослых тканей». Cell Biol. Toxicol. 8: 43–61.

Google ученый

ДЕНИЗО, Ф., и МАРИОН, М. (1984). «Культивирование радужной форели и клеток человека, подвергшихся воздействию ПХД, при оценке цитотоксичности водных загрязнителей.Water Res. 18: 247–251.

Google ученый

DEVAUX, A., PESONEN, M., MONOD, G., and ANDERSSON, T. (1992). «Глюкокортикоид-опосредованное усиление индукции P450 в первичной культуре гепатоцитов радужной форели». Биохим. Pharmacol. 43: 898–901.

Google ученый

АЛМАЗ, Л., МАКФАЛЛ, Р., ТАШИРО, Ю. и САБАТИНИ, Д. (1973). «Клеточные линии печени крысы WIRL-3 и их трансформированные производные.«Cancer Res. 33: 2627–2636.

Google ученый

ELCOMBE, C.R., and LECH, J.J. (1979). «Индукция и характеристика гемопротеина (ов) P-450 и монооксигенация у радужной форели ( Salmo gairdneri )». Toxicol. Прил. Pharmacol. 49: 437–450.

Google ученый

FAUSTO, N., THOMPSON, N.L., and BRAUN, L. (1987). «Очистка и культивирование овальных клеток печени крысы.В разделе «Разделение клеток: методы и избранные приложения» (Т. Г. Претлоу и Т. П. Претлоу, ред.). Академик Пресс, Орландо, Флорида. С. 45–77.

Google ученый

Фрайер, Дж. Л., Маккейн, Б. Б., и ЛЕОН, Дж. К. (1981). «Клеточная линия, полученная из гепатомы радужной форели ( Salmo gairdneri )». Fish Pathol. 15: 193–200.

Google ученый

ГОКСЁЙР, А., ФЕРЛИН, Л.(1992). «Система цитохрома P-450 в рыбах, водной токсикологии и мониторинге окружающей среды». Акват. Toxicol. 22: 287–312.

Google ученый

GRISHAM, J.W. (1980). «Типы клеток в культурах печени крыс для длительного размножения». Анна. N.Y. Acad. Sci. 349: 128–137.

Google ученый

HEILMANN, L.J., SHEEN, S.W., BIEGELOW, S.W., и NEBERT, D.W. (1988). «Форель P-450IA1: кДНК и предполагаемая последовательность белка, экспрессия в печени и эволюционное значение.”ДНК 7: 379–387.

Google ученый

HERING, S., GRIFFIN, B.E., and STRAUSS, M. (1991). «Иммортализация фетальных синусоидальных клеток печени человека большим Т-антигеном вируса полиомы». Exp. Cell Res. 195: 1–7.

Google ученый

HIGHTOWER, L.E., и RENFRO, J.L. (1988). «Недавние применения культуры клеток рыб в биомедицинских исследованиях». J. Exp. Zool. 248: 290–302.

Google ученый

HINTON, D.E., LANTZ, R.C., HAMPTON, J.A., MCCUSKEY, P.R., and McCUSKEY, R.S. (1987). «Нормальная и ненормальная структура: соображения морфологической реакции костистых на загрязняющие вещества». Environ. Перспектива здоровья. 71: 139–146.

Google ученый

IDOINE, J.B., ELLIOTT, J.M., WILSON, M.J., и WEISBURGER, E.K. (1976). «Клетки печени крысы в ​​культуре: влияние хранения, длительного культивирования и трансформации на некоторые уровни ферментов.”In Vitro 12: 541–553.

Google ученый

KLAUNIG, J.E., RUCH, R.J., and GOLDBLATT, P.J. (1985). «Культура гепатоцитов форели: выделение и первичная культура». In vitro Cell Dev. Биол. 21: 221–227.

Google ученый

LEE, L.E.J. и BOLS, N.C. (1989). «Рецептор кортикостероидов и действие различных стероидов на фибробласты радужной форели». Gen. Comp.Эндокринол. 74: 85–95.

Google ученый

ЛЕЙБОВИТЦ, А. (1963). «Рост и поддержание культур клеток тканей в условиях свободного газообмена с атмосферой». Являюсь. J. Hyg. 78: 173–180.

Google ученый

ЛИПСКИ М.М., ШЕРИДАН Т.Р., БЕННЕТТ Р.О. и МЭЙ, Э. (1986). «Сравнение культуры гепатоцитов форели на разных субстратах». In vitro Cell. Dev.Биол. 22: 360–362.

Google ученый

LORENZANA, R.M., HEDSTROM, O.R., GALLAGHER, J.A., and BHLER, D.R. (1989). «Распределение изофермента цитохрома P450 в нормальной и опухолевой ткани печени радужной форели ( Salmo gairdneri )». Exp. Мол. Патол. 50: 348–361.

Google ученый

LORENZEN, A., and OKEY, A.B. (1990). «Обнаружение и характеристика связывания [ ³ H] -2,3,7,8-тетрахлордибензо- p -диоксина с рецептором Ah в клеточной линии гепатомы радужной форели» Toxicol.Прил. Pharmacol. 106: 53–62.

Google ученый

MARCEAU, N., GERMAIN, L., GOYETT, R., NOEL, M., and GOURDEAU, H. (1986). «Клетка происхождения отдельных культивируемых эпителиальных клеток печени крысы, типичных для селективной экспрессии цитокератина и поверхностных компонентов». Биохим. Cell Biol. 64: 788–802.

Google ученый

НАРИТА, Т. (1990). «Аутокринный фактор роста и спонтанная трансформация эпителиальных клеток печени крыс.”In vitro Cell. Dev. Биол. 26: 330–334.

Google ученый

НИКОЛСОН, Б.Л. (1989). «Культура рыбных клеток: обновление». Adv. Cell Cult. 7: 1–18.

Google ученый

PERTOFT, H., and SMEDSROD, B. (1987). «Разделение и характеристика клеток печени». В: Разделение клеток: методы и избранные приложения. (T.G. Pretlow и T.P. Pretlow, ред.). Академик Пресс, Орландо, Флорида.С. 1–24.

Google ученый

ПЕСОНЕН М. и АНДЕРССОН Т. (1991). «Характеристика и индукция активности ферментов, метаболизирующих ксенобиотики, в первичной культуре гепатоцитов радужной форели». Xenobiotica 21: 461–471.

Google ученый

ПЕСОНЕН М., ГОКСЁЙР А. и АНДЕРССОН Т. (1992). «Экспрессия P4501A1 в первичной культуре гепатоцитов радужной форели, подвергшейся воздействию β-нафтофлавона или 2,3,7,8-тетрахлордибензо- p -диоксина.Arch. Биохим. Биофиз. 292: 228–233.

Google ученый

ПОЛ, Р.Дж., и Фаутс, Дж. Р. (1980). «Экспресс-метод анализа метаболизма 7-этоксирезоруфина с помощью микросомальных субклеточных фракций». Анальный. Биохим. 107: 150–155.

Google ученый

SAN, R.H.C., LASPIA, M.F., SOIEFER, A.I., MASLANSKY, C.J., RICE, J.M., and WILLIAMS, G.M. (1979). «Исследование роста мягкого агара и свойств поверхности клеток как маркеров трансформации в культурах эпителиоподобных клеток печени взрослых крыс».Cancer Res. 39: 1026–1034.

Google ученый

SAWADA, N., TOMOMURA, A., STATTLER, C.A., SATTLER, G.L., KLEINMAN, H.K. PITOT, H.C. (1987). «Влияние компонентов внеклеточного матрикса на рост и дифференциацию культивируемых гепатоцитов крыс». In vitro Cell. Dev. Биол. 23: 267–273.

Google ученый

SCHRENK, D., EISENMANN-TAPPE, E., GEBHARDT, R., MAYER, D., EL MOUELHI, M., ROHRDANZ, E., MPUNZEL, P., and BOCK, K.W. (1991). «Активность ферментов метаболизма лекарств в эпителиальных клеточных линиях печени крыс, гепатоцитах и ​​клетках желчных протоков». Биохим. Pharmacol. 41: 1751–1757.

Google ученый

SMOLOWITZ, R.M., HANN, M.E., and STEGEMAN, J.J. (1991). «Иммуногистохимическая локализация цитохрома P-450IA1, индуцированная 3,3 ‘, 4,4’-тетрахлорбифенилом и 2,3,7,8-тетрахлордибензо [a] -фураном, в печени и внепеченочных тканях костистости Stenotomus chrysops (скап).«Drug Metab. Dispos. 19: 113–123.

Google ученый

ТИЛЛИТТ, Д.Е., и ГИЗИ, Дж. П. (1991). «Характеристика биоанализа клеток гепатомы крысы h5IIE как инструмента для оценки токсической активности планарных галогенированных углеводородов в образцах окружающей среды». Environ. Sci. Technol. 25: 87–92.

Google ученый

ЦАО, М.С., СМИТ, Д.Д., НЕЛЬСОН, К.Г., и ГРИШАМ, Дж.W. (1984). «Линия диплоидных эпителиальных клеток из печени нормальной взрослой крысы с фенотипическими свойствами« овальных »клеток». Exp. Клетка. Res. 154: 38–52.

Google ученый

WILLIAMS, G.M., WEISBURGER, E.K., и WEISBURGER, J.H. (1971). «Выделение и длительное культивирование эпителиоподобных клеток из печени крысы». Exp. Cell Res. 69: 106–112.

Google ученый

ZAR, J.Х. (1974). Биостатистический анализ. Прентис Холл, Энглвуд Клиффс, Нью-Джерси. С. 130–162.

Google ученый

Влияние Pro-IGF-I Ea4-пептида на морфологические изменения и независимый от закрепления рост на JSTOR

Abstract

Наша лаборатория ранее показала, что рекомбинантный Ea4 (rtEa4) -пептид проинсулиноподобного фактора роста-I (про-IGF-I) радужной форели проявляет противоопухолевую активность против линий раковых клеток, полученных из различных раковых тканей человека (Chen et al. al., 2002; Куо и Чен, 2002). Чтобы подтвердить, что пептид rtEa4 может проявлять такой же спектр противоопухолевой активности в опухолевых клетках рыб, мы разработали постоянные одноклеточные клоны (RTh2B1A, RTh2B1D, RTh2B2A и RTh2B2C) из опухоли печени радужной форели, вызванной дибензо [a, l ] обработка пирена. При 135 пассажах время удвоения этих одноклеточных клонов в $ CO_2-независимой среде при 20 ° C составляло 3,9, 3,5, 3,0 и 4,5 дня соответственно. Анализ полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией показал, что экспрессия генов сигнатуры печени (например,g., альдолаза B, глюкозо-6-фосфатаза [G-6-Pase], фосфоенолпируваткарбоксикиназа [PEPCK], ядерный фактор 1 печени [HNF-I], IGF-I, IGF-II и гормон роста [GH] гены рецептора-2) и гены CYP1A1 и CYP1A3 были обнаружены в этих четырех одноклеточных клонах. Кроме того, результаты анализа образования колоний in vitro в среде с мягким агаром показали различную степень активности колониеобразования среди них. Эти результаты подтвердили, что одноклеточные клоны были получены из печени радужной форели. Обработка RTh2B1D рекомбинантным пептидом Ea4 форели приводила к индукции дозозависимого морфологического изменения и подавлению образования колоний в среде с мягким агаром.Кроме того, как морфологические изменения, так и уменьшение образования колоний также наблюдались в перманентных трансфектантах клеток RTh2B1D, несущих ген Ea4-пептида форели или его человеческий аналог, ген hEb-пептида. Эти результаты подтверждают наши более ранние наблюдения, что форелевый пре-IGF-I Ea4-пептид и hEb обладают активностями, противодействующими злокачественным свойствам раковых клеток in vitro.

Информация журнала

In vitro Cellular & Developmental Biology — Animal представляет рецензируемые рукописи, посвященные культивированию in vitro клеток, тканей, органов и опухолей беспозвоночных и позвоночных.Этот журнал, публикуемый ежемесячно с объединенными выпусками в июле / августе и ноябре / декабре, является обязательным к прочтению для ученых, работающих в области культуры клеток и тканей позвоночных и беспозвоночных. Предлагает оригинальные статьи по актуальным вопросам, например, специальные серии статей о стволовых клетках и исследования NASA по биотехнологии / клеточной науке в условиях микрогравитации. Клеточная биология и биология развития in vitro. Animal продолжает исследования в области клеточной биологии и биологии развития in vitro. Клеточная биология и биология развития in vitro была частично продолжена In vitro Cellular & Developmental Biology.Завод в январе 1991 года и продолжение In vitro Cellular & Developmental Biology. Животное в марте 1993 года.

Информация об издателе

Общество биологии in vitro (SIVB) было основано в 1946 году как Ассоциация культур тканей для содействия обмену знаниями о биологии клеток, тканей и органов растений и животных (включая человека) in vitro. Основное внимание уделяется биологическим исследованиям, разработкам и приложениям, имеющим значение для науки и общества. Миссия осуществляется через публикации Общества; национальные и местные конференции, встречи и семинары; и через поддержку учебных инициатив в сотрудничестве с образовательными учреждениями.За прошедшие годы SIVB расширился, чтобы создать среду для научного обмена и междисциплинарного взаимодействия с целью развития существующих и будущих систем для биологии in vitro.

Радуга света для изображения клеток крови — MEDICA

Этот оптический прибор, размером не больше хлебной корзины, может обеспечить изображения с высоким разрешением крови, текущей по нашим венам, без использования резких и недолговечных флуоресцентных красителей.

«Мы изобрели новый оптический микроскоп, который может видеть отдельные клетки крови, когда они текут внутри нашего тела», — говорит Лиор Голан из Израильского технологического института.Устраняя длительное время ожидания результатов анализа крови, новый микроскоп может помочь выявить предупреждающие знаки, такие как высокое количество лейкоцитов, до того, как у пациента разовьются серьезные проблемы со здоровьем. Портативность устройства также может позволить врачам в сельских районах, не имеющих легкого доступа к медицинским лабораториям, проверять большие группы населения на общие заболевания крови, отмечает Голан.

С помощью нового микроскопа исследователи изобразили кровь, текущую через сосуд в нижней губе добровольца.Они успешно измерили средний диаметр красных и белых кровяных телец, а также вычислили процентный объем различных типов клеток, что является ключевым показателем для многих медицинских диагнозов.

Устройство использует метод, называемый конфокальной микроскопией со спектральным кодированием (SECM), который создает изображения путем разделения светового луча на составляющие его цвета. Цвета распределены по линии от красного до фиолетового. Для сканирования движущихся клеток крови зонд прижимается к коже пациента, и радужная линия света направляется через кровеносный сосуд у поверхности кожи.Когда клетки крови пересекают линию, они рассеивают свет, который собирается и анализируется. Цвет рассеянного света несет в себе пространственную информацию, и компьютерные программы интерпретируют сигнал с течением времени для создания двухмерных изображений клеток крови.

В настоящее время существуют и другие системы сканирования крови с клеточным разрешением, но они гораздо менее практичны, полагаясь на громоздкое оборудование или потенциально вредные флуоресцентные красители, которые необходимо вводить в кровоток.

«Важной особенностью метода является то, что он полагается на отраженный свет от текущих клеток для формирования их изображений, что позволяет избежать использования флуоресцентных красителей, которые могут быть токсичными», — говорит Голан.«Поскольку клетки крови находятся в постоянном движении, их внешний вид заметно отличается от окружающей их статической ткани». Методика команды также использует односторонний поток клеток для создания компактного зонда, который может быстро отображать большое количество клеток, оставаясь неподвижным на коже.

MEDICA.de; Источник: Оптическое общество Америки

Штрих-кодирование радужной клетки: флуоресцентные полимерные наночастицы

Метод, позволяющий долгое время маркировать различные популяции клеток десятками разных цветов с использованием флуоресцентных наночастиц.

Дифференциация и отслеживание различных популяций клеток представляет большой интерес для понимания их взаимодействия в сложных биологических системах. Следование таким системам in vitro и in vivo в течение нескольких недель может помочь решить ключевые вопросы исследований рака, дифференциации клеток, клеточной терапии, регенеративной медицины и эмбриогенеза.

Недавно была использована реализация множества функций в наночастицах (NP). Однако реализация нескольких функций в пределах одного и того же NP требует сложных синтетических процедур, которые не всегда могут обеспечить высокую воспроизводимость свойств NP.Стоимость, эффективность и токсичность этих НЧ еще предстоит решить.

В недавно опубликованном исследовании Андреас Райш, Андрей С. Климченко и его коллеги из Франции разработали метод, позволяющий в течение длительного времени маркировать различные популяции клеток десятками разных цветов с использованием флуоресцентных наночастиц. Их подход основан на наборе из 3 нагруженных красителем наночастиц, изготовленных из биоразлагаемого полимера PLGA. Наночастицы содержат один из трех цианиновых красителей, DiO, DiI или DiD, с различными цветами возбуждения и излучения, которые эффективно инкапсулируются при высокой концентрации с использованием объемных фторированных противоионов.Полученные частицы размером 40 нм в 20 раз ярче, чем квантовые точки аналогичного цвета. Таким образом, три типа наночастиц имеют разные цвета, но одинаковые размеры и свойства поверхности, что делает их взаимодействие с биологическими системами идентичным.

Три типа наночастиц одинаково хорошо эндоцитируются многочисленными клеточными линиями, что приводит к однородному окрашиванию всей популяции клеток. Смешивание наночастиц трех цветов в разных пропорциях можно затем использовать для создания однородного штрих-кода RGB в ячейках, который точно передается через многие поколения клеток.

Различные типы клеток, помеченные таким образом, можно легко различить в сокультурах различных клеточных линий в течение нескольких недель. У рыбок данио раковые клетки, закодированные разными цветами, можно было легко отслеживать in vivo, в то время как прямая микроинъекция этих частиц в эмбрионы рыбок данио использовалась для мониторинга морфогенеза в шести разных цветах.

Разработанный подход представляет собой ценный инструмент для изучения сложных систем in vitro и in vivo без их генетической модификации.

Любезно предоставлено авторами и отредактировано Джоди Хей.

Выявление гетерогенности бета-клеток путем отслеживания происхождения — ScienceDaily

Д-р Николай Нинов, руководитель группы исследовательского центра регенеративной терапии DFG в Дрездене (CRTD), Cluster of Excellence в Техническом университете Дрездена и Института Пола Лангерганса в Дрездене (PLID ), и его группа разработала систему под названием «Бета-лук», которая позволяет проследить историю β-клеток с помощью генетического штрихового кодирования и многоцветной визуализации. Результаты этого исследования опубликованы в научном журнале Nature Communications.

Прослеживание истории отдельных клеток в развивающемся организме может выявить функциональные различия между, казалось бы, однородными клетками. Эти знания важны для определения характеристик высокорегенеративных клеток, чтобы нацелить их на клеточную терапию, а также для предотвращения образования непригодных клеток, которые ставят под угрозу общее состояние здоровья организма. Представленное здесь исследование представляет новый метод отслеживания истории β-клеток, которые выполняют важную функцию секреции инсулина в ответ на глюкозу.Авторы проследили β-клетки в отношении их пролиферации, функции и времени дифференцировки у рыбок данио. Исследование показывает, что β-клетки с разными историями развития сосуществуют вместе, что приводит к формированию динамических субпопуляций, которые различаются по своему потенциалу к пролиферации и выполнению функциональных задач. Исследование также показывает начало функции β-клеток у рыбок данио, что открывает новые возможности для изучения того, как β-клетки приобретают функциональное состояние, используя эту мощную генетическую модель.

Недавно стала очевидной гетерогенность среди β-клеток, и считается, что эта гетерогенность может играть роль в прогрессировании диабета. «Например, даже через 20 лет после начала диабета 1 типа некоторые β-клетки могут выжить в поджелудочной железе, возможно, потому, что эти клетки отличаются от остальных, что позволяет им скрыться от иммунной системы и избежать аутоиммунного разрушения, «- говорит Николай Нинов. Возможность непосредственно визуализировать эволюцию гетерогенности β-клеток у рыбок данио поможет понять динамическую регуляцию субпопуляций β-клеток на молекулярном уровне.Эти знания имеют решающее значение для последующей разработки эффективных стратегий регенерации и защиты β-клеток при диабете.

«В качестве следующего шага мы будем использовать нашу модель и методы отслеживания клеток, чтобы понять сигналы, которые инструктируют β-клетки о переходе в функциональное состояние. В частности, мы обнаружили, что у рыбок данио этот процесс занимает всего несколько дней после рождения клетки, в то время как формирование функциональных β-клеток из стволовых клеток человека затруднено in vitro.Таким образом, наша гипотеза состоит в том, что среда in vivo в поджелудочной железе рыбок данио обеспечивает мощные сигналы для быстрого функционального созревания β-клеток. Теперь мы определим эти сигналы, поскольку эти знания могут помочь в производстве функциональных человеческих β-клеток in vitro для целей трансплантации », — объясняет Николай Нинов.

Проект, задуманный 3,5 года назад, возглавил CRTD Postdoc Sumeet Pal Singh. Кроме того, Шаран Джанджуха (аспирант, DIGS-BB) разработал анализ для визуализации кальция.Дополнительные исследователи включают сотрудников из Японии (Daiichi Sankyo Co., Ltd), Великобритании (Оксфордский университет) и Германии (CRTD).

«Любопытство и стремление внести оригинальный вклад в лекарство от диабета, узнав больше об основах биологии β-клеток», мотивирует Николая Нинова в его повседневной работе. С 2013 года Николай Нинов был руководителем группы «Биология β-клеток и регенерация» в CRTD и Дрезденском институте Пауля Лангерганса (PLID) Гельмгольца центра Мюнхена при Университетской больнице Дрездена и на медицинском факультете Карла Густава Каруса из Технического университета Дрездена — a партнер Немецкого центра исследований диабета (DZD).В 2008 году Николай Нинов защитил кандидатскую диссертацию в Барселонском университете (Испания, Parc Cientific de Barcelona). После этого он работал постдоком в Университете Торонто (Канада, Департамент клеточной и системной биологии, 2008-2009 гг.