Как нарисовать косичку по клеточкам: Как нарисовать косичку по клеточкам

Содержание

Смешарики карандашом поэтапно. Как нарисовать ежика из смешариков карандашом поэтапно

Беременность

Забавные обитатели страны Шаршарам — идеальные модели для детского творчества. Смешариков можно рисовать как и где угодно: на асфальте, тетрадном листе в клеточку, оконном стекле, в альбоме. Учимся рисовать смешариков вместе.

Рисовать по клеточкам могут все: и взрослые, и дети. Все, что необходимо для создания шедевра, — немножко терпения, цветные карандаши (фломастеры, ручки), тетрадный лист в клеточку или миллиметровая бумага. Распечатав шаблон, можете немедленно приступить к рисованию по клеточкам любимых мультяшных героев.

Если вашему юному дарованию 4-5 лет, и он только начинает осваивать рисование по клеточкам, обратите внимание на важный момент: начинать работу нужно с обсуждения будущего рисунка!

Внимательно рассмотрите схему рисунка. Обсудите цветовое решение изображения. Выберите необходимые карандаши (фломастеры и т.д.)
Объясните вашему художнику принцип рисования по клеточкам.

Дайте ребенку выбрать клеточку, с которой он начнет свое рисование. Обсудите, почему он выбрал именно эту клетку. Помогите найти эту клетку на листе для рисования.
Помните, что в возрасте 4-5 лет ребенок не отличается усидчивостью взрослого человека. Время занятия не должно превышать 15-20 минут. Количество занятий — 1-2 раза в день.

Совет: чтобы заинтересовать малыша, предварительно нарисуйте рисунок по клеточкам, «забыв» какой-то небольшой элемент. Попросите ребенка дорисовать недостающую деталь, ориентируясь на готовую схему.

Нюша

Учимся рисовать Нюшу по клеточкам.

Рисунок по клеточкам: Нюша Рисунок по клеточкам: Нюша

Бараш

Учимся рисовать Бараша по клеточкам.

Рисунок по клеточкам: Бараш Рисунок по клеточкам: Бараш

Крош

Учимся рисовать Кроша по клеточкам.

Рисунок по клеточкам: Крош Рисунок по клеточкам: Крош

Совунья

Учимся рисовать Совунью по клеточкам.

Рисунок по клеточкам: Совунья

Пин

Учимся рисовать Пина по клеточкам.

Рисунок по клеточкам: Пин

Рисунок по клеточкам: Пин

Лосяш

Учимся рисовать Лосяша по клеточкам.

Рисунок по клеточкам: Лосяш Рисунок по клеточкам: Лосяш

Копатыч

Учимся рисовать Копатыча по клеточкам.

Рисунок по клеточкам: Копатыч

Кар-Карыч

Учимся рисовать Кар-Карыча по клеточкам.

Рисунок по клеточкам: Кар-Карыч

Ежик

Учимся рисовать Ежика по клеточкам.

Рисунок по клеточкам: Ежик

Рисунок по клеточкам: Ежик

Для начала потренируйтесь рисовать круг. Этот навык пригодится, если вы планируете время от времени заниматься рисованием.

Легко и без нажима проведите две взаимно перпендикулярные линии. Вы получите луча, образующих 4 прямых угла.
Каждый из прямых углов разделите пополам. Теперь у вас на рисунке 8 лучей, расходящихся из одной, центральной, точки. На каждом луче отмерьте одинаковые отрезки (см. рисунок).
Через полученные точки проведите окружность.

Итак, у вас нарисована окружность, в центре которой пересекаются горизонтальная и вертикальная линии (горизонтальная и вертикальная ось).

Дело осталось за малым: прорисовать детали.

Как нарисовать Кроша из смешариков карандашом поэтапно?

Работая над Совуньей, обратите внимание ребенка на тот факт, что Совунья — птица. Попросите ребенка назвать отличительные черты птицы и животного. Обсудив все важные детали, можно приступать к работе над рисунком. На схеме, в поле справа, вынесены элементы, работа над которыми требует особого внимания.

Как нарисовать Совунью из смешариков карандашом поэтапно?

И еще одна, достаточно простая, схема рисования любимого героя.

Как нарисовать Совунью из смешариков карандашом поэтапно?

Один из самых сложных элементов в изображении Бараша — закрученные спиралью рога. Попробуйте нарисовать спираль, опираясь на схему, предложенную внизу.

На основной схеме, в поле справа, вынесены элементы, работа над которыми требует особого внимания.

Как нарисовать Бараша из смешариков?

И еще одна пошаговая схема для закрепления полученных навыков.

Как нарисовать Бараша из смешариков?

Нюша — неземная красота, муза Бараша

Несмотря на то, что Нюша — эталон неземной красоты, рисовать ее достаточно легко.

Как нарисовать Нюшу из смешариков?

Как нарисовать Лосяша из смешариков?

Самая сложная деталь, над которой придется потрудиться, рисуя Лосяша — его шикарные рога. Обратите внимание на поле, расположенное справа (см. схему). Следуйте предложенному алгоритму, и у вас не возникнет сложностей с изображением лосиной короны.

Новогодние рисунки смешариков на окнах

Любой из предложенных выше рисунков можно изобразить на окне.

А сделать его разноцветным или монохромным — решать вам.

Видео: НОВОГОДНИЙ декор ЗУБНОЙ пастой?? | DIY Как украсить окна на НОВЫЙ ГОД 2017

Мультфильм «Смешарики» для поколений малышей последних 10 лет является неотъемлемой частью детства. Еще бы: футболки, кружки, полотенца — все вокруг пестрит изображениями Кроша, Нюши, Лосяша и их друзей. Так что для вас и ваших карапузов рекомендации о том, как нарисовать смешариков карандашом поэтапно, будут наверняка полезны и интересны.

Простые и смешные шарики

Забавные персонажи, эдакие современные колобки, обладают очень яркими индивидуальностями. Несмотря на то, что у них одинаковые тела — голова и туловище совмещаются в одном шаре — каждый из смешариков имеет какую-то деталь, выделяющую его среди товарищей. Неудивительно, что дети с удовольствием рисуют героев-шариков с забавными мордашками. Но прежде чем остановиться на деталях рисования забавных колобков, давайте определимся с нюансами изображения, которые будут общими для всех жителей Страны смешариков.

Три этапа — и смешарик готов

Процесс изображения любого персонажа любимого мультфильма нужно воплощать последовательно. Так что, если вы хотите узнать, как нарисовать ссмешариков всех вместе, обратите внимание на нашу инструкцию.

Выбор смешарика. Это позволит определиться с особенностями, которые будет необходимо воплотить в рисунке (клюв, копыта, форма носа и т. д).

Рисунок основы. Для любого персонажа необходимо нарисовать круг и провести в нем две пересекающиеся прямые, чтобы получилось 4 сектора. Только учтите, что для изображения анфас эти четвертинки будут одинаковыми, а вот для смешарика, стоящего вполоборота, придется делать смещение центра влево или вправо. В любом случае нос персонажа будет располагаться на пересечении этих линий.
Детализация. Начинать прорисовывать мордочку лучше с круглого носика, а затем добавить большие глаза. Они расположены очень близко к носу и составляют около трети всего шара-основы. Завершаем изображение лица прорисовкой рта, щечек и бровей. Конечности добавляем плотно прилегающими к телу, с обозначенными пальцами или когтями. В конце добавляем волосы, рога и ушки. И, конечно, аксессуары: очки для смешного Ежика, элегантная бабочка для умного Кар-Карыча и т. д.

Веселый Крош

Темпераментный кролик, неутомимый советчик во всех вопросах, никогда не унывает. А еще он часто моргает. В общем, вполне достойный кандидат на звание самого популярного смешного героя. Как поэтапно нарисовать Кроша из смешариков карандашом?

Инструкция:

Барашек, или, как его называют, Бараш, — поэт и мечтатель. Изобразить эту творческую личность труда не составит. Как нарисовать Бараша из Смешариков карандашом поэтапно для начинающих?

Инструкция:

Проказницу Панди любят все детки, хоть иногда она бывает очень-очень непослушной.

Инструкция:

Настоящая принцесса Нюша

Влюбленная в Бараша свинка очень близка девочкам-малышкам своими переодеваниями по несколько раз в день, а также добрым сердечком и уживчивым характером.

Инструкция:

Все любят Смешариков, а те кто не любят, значит еще их не посмотрели! Сегодня мы разберем три примера, которые продемонстрируют как нарисовать Ежика из Смешариков. Конечный результат всех параграфов будет примерно одинаковым, различия будут скрываться в процессе и технике рисования. Поэтому запасайтесь теплым чаем, наточенными карандашами и ластиком, мы приступаем к урокам рисования!

Подробный пример

Сначала постараемся максимально подробно разобрать как поэтапно нарисовать Ежика из Смешариков, а следующие примеры будут немного покороче.

Итак, первое что нам нужно сделать — изобразить ровный круг. Внутри него еще два круга, он в будущем станут глазами. Над ними нарисуем брови в виде черточек.

Детализируем лицо добавив глаза, рот и нос. Наш ежик будет с шипами, поэтому сверху нужно изобразить один из шипов. Он должен расположиться прямо по центру.

Подрисовываем шипы по кругу, они должны получаться приблизительно одного размера. Также, добавим короткие ножки и руки.

Берем в руки ластик и стираем все вспомогательные линии. Затем черным маркером обводим оставшиеся линии.

Теперь раскрашивание. Внимательно изучите рисунок. Мы закрашиваем не сплошным цветом. Некоторые места получаются темнее, а некоторые светлее. Таким образом мы делаем рисунок реалистичнее.

Как в мультике

Этот параграф продемонстрирует как нарисовать Ежика из Смешариков карандашом. Он будет выглядеть точно также как в мультфильме!

Начало у нас очень простое. Нужно начертить ровный круг с вмятиной сверху. Если у вас проблемы с изображением ровных кругов, то вы можете воспользоваться циркулем, либо обвести круглую чашку.

Рисуем все детали лица: очки, глаза, рот, нос, уши и брови.

Добавляем шипы, ножки и руки. Конечности не должны получится слишком длинными.

Простой рисунок

Ну а последний параграф расскажет нам как нарисовать Ежика из мультика Смешарики в тетради в клеточку. Эта техника рисования достаточно простая, поэтому она отлично подойдет для детей любого возраста!

Итак, сначала делаем набросок, состоящий из контуров туловища и лица.

Детализируем набросок подрисовывая конечности и шипы. Также, закрасим очки в черный цвет.

После того как вы раскрасите Ежика, рисунок можно считать готовым!

Весельчак. Он частенько перебивает своих собеседников, экспериментировать и путешествовать. Нарисовать его проще простого. Сперва на листе бумаги нужно изобразить окружность, разделенную двумя перпендикулярными линиями на 4 одинаковые части. Затем Крошу следует овальные глазки, круглый нос-пуговку, бровки, улыбку с двумя торчащими зубами и длинные уши. После этого смешарику необходимо дорисовать овальные передние и задние лапки и раскрасить в голубой цвет.

Ежик – лучший друг Кроша. Он очень серьезен и рассудителен, но часто не уверен в себе. Ежик обладает отменным воспитанием. В общем, он настоящий интеллигент. Основа Ёжика – окружность с вырезанным из верхней ее части треугольником. Посредине окружности нужно нарисовать треугольный носик. Выше его – большие круглые очки и маленькие бровки. По бокам следует нарисовать аккуратненькие ушки. Далее смешарику необходимо нарисовать треугольные иголки, ручки и ножки. Самого Ежика следует раскрасить в розовый цвет, а иголки его – в фиолетовый.

Еще один забавный герой мультсериала «Смешарики» — это поэт-лирик Бараш. Он постоянно вздыхает и сочиняет стихи. Бараш влюблен в Нюшу. Но попытки смешарика проявить свою симпатию к ней не всегда заканчиваются удачно.Нарисовать этого смешарика не труднее других. Сперва на бумаге нужно изобразить окружность. В ней — нарисовать круглые глаза, широкий треугольный нос и маленький ротик. Далее Барашу следует дорисовать ушки, круглые, похожие на завитушки, рога, ручки и ножки. Тело смешарика нужно обвести волнистой линией. Раскрасить Бараша следует в светло-фиолетовый цвет.

Нюша – мечтающая поскорее стать взрослой девочка-хрюшка. Она всегда следит за своей внешностью, модничает и, вообще, считает себя необычайно красивой. Нюша всегда старается быть в центре всеобщего внимания.Чтобы нарисовать Нюшу, нужно, для начала, изобразить большую окружность, а в ней еще одну маленькую. Далее Нюше нужно нарисовать выразительные глазки, носик-пятачок, аккуратненький ротик, ушки, лапки и озорную косичку, заплетенную из волос девочки-смешарика.

Клетки печени, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток макак-косичек, поддерживают инфицирование вирусом гепатита С

Сравнительное исследование

. 2013 ноябрь;145(5):966-969.e7.

doi: 10.1053/j.gastro.2013.07.026. Epub 2013 25 июля.

Марион Суриссо

1 , Орит Голдман, Венкиан Хе, Дженнифер Л. Гори, Ханс-Питер Кием, Валери Гуон-Эванс, Мэтью Дж. Эванс

Принадлежности

принадлежность

¹ Кафедра микробиологии, Медицинская школа Икана на горе Синай, Нью-Йорк, Нью-Йорк.

PMID: 23891978
PMCID: PMC3805793
DOI: 10.1053/ж.гастро.2013.07.026

Бесплатная статья ЧВК

Сравнительное исследование

Marion Sourisseau et al.

Гастроэнтерология. 2013 ноябрь

Бесплатная статья ЧВК

. 2013 ноябрь;145(5):966-969.e7.

doi: 10.1053/j.gastro.2013.07.026. Epub 2013 25 июля.

Авторы

Марион Суриссо ¹, Орит Голдман, Вэньцянь Хе, Дженнифер Л. Гори, Ханс-Питер Кием, Валери Гуон-Эванс, Мэтью Дж. Эванс

принадлежность

¹ Кафедра микробиологии, Медицинская школа Икана на горе Синай, Нью-Йорк, Нью-Йорк.

PMID: 23891978
PMCID: PMC3805793
DOI: 10. 1053/ж.гастро.2013.07.026

Абстрактный

Узкий видовой тропизм вируса гепатита С (ВГС) ограничивает исследования на животных. Мы обнаружили, что клетки печени макаки косички (Macaca nemestrina), полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, поддерживают весь жизненный цикл ВГС, хотя эффективность инфекции была ограничена дефектами в процессе проникновения клеток ВГС. Этот блок был преодолен путем либо увеличения экспрессии окклюдина, комплементации клеток человеческим CD81, либо инфицирования их штаммом HCV с менее ограниченными потребностями в CD81. Используя эту систему, мы можем изменить генетику вируса и клетки-хозяина, чтобы сделать макак с косичками подходящей, клинически значимой моделью для изучения инфекции ВГС.

Ключевые слова: 2’C-метиладенозин; 2’СМА; Модель животного; Глюк; гауссийская люцифераза; ВГС; ВГСcc; ВГПрр; вирус гепатита С; макака неместрина; Macaca nemestrina индуцировала плюрипотентные стволовые клетки; Гепатоцитоподобные клетки, полученные из Macaca nemestrina; Мн; MnHep; МниПСК; Обезьяна; ОКЛН; репликация; ВСВГпп; вирус гепатита С, полученный из клеточной культуры; вирус гепатита С; псевдочастицы вируса гепатита С; окклюдин; Гликопротеин вируса везикулярного стоматита.

Цифры

Рисунок 1. Клетки MnHep поддерживают инфекцию ВГС

Чтобы оценить их способность поддерживать инфекцию ВГС,…

Рисунок 1. Клетки MnHep поддерживают инфекцию ВГС.

Для оценки их способности поддерживать инфекцию ВГС клетки Huh7.5 и MnHep подвергали заражению ВГС дикого типа, который не кодирует репортерный ген. В указанное время после трансфекции (A) внутриклеточную и (B) внеклеточную РНК количественно определяли с помощью qRT-PCR. 2’CMA, ингибитор полимеразы ВГС, был включен в параллельные инфекции, чтобы продемонстрировать уровни РНК, независимые от репликации. Значения представляют собой количество копий РНК ВГС, определенное относительно стандартной кривой в зависимости от количества общей РНК для внутриклеточных образцов или объема супернатанта для внеклеточных образцов. (С) В 9Через 6 часов после инфицирования (h.p.i.) ложные или зараженные ВГС клетки, с 2’CMA или без него, подвергали иммуноокрашиванию на гликопротеин Е2 ВГС (красный) и контрастному окрашиванию Hoechst (синий). (D) Инфекционный ВГС в супернатантах, собранных при 48 л.с. определяли количественно с помощью анализа предельного разведения на клетках Huh-7.5 и выражали как инфекционную дозу 50% тканевой культуры на мл (TCID50/мл). Средние значения и стандартные отклонения трех независимых экспериментов, каждый из которых проводился в трех повторностях. *** П

Рисунок 2. Клеточные и вирусные детерминанты…

Рисунок 2. Клеточные и вирусные детерминанты проникновения ВГС в клетки MnHep

Трансдуцированные клетки MnHep…

Рисунок 2. Клеточные и вирусные детерминанты способности клеток MnHep к проникновению ВГС

клетки MnHep, трансдуцированные для экспрессии только GFP в качестве отрицательного контроля или указанных факторов проникновения клеток HCV, подвергали заражению GLuc, экспрессирующим (A) HCVpp или (B) HCVcc. Инфекции проводили параллельно с нейтрализующим антителом против ВГС (анти-Е2). Значения GLuc измеряли при 48 л.с. для HCVpp или указанные времена для HCVcc, нормализованные к параллельным инфекциям VSVGpp и установленные относительно инфекции клеток Huh-7.5 с высокой пермиссивностью. Три независимых эксперимента, каждый из которых выполнен с шестью повторами, и статистические данные относятся только к GFP. Наивные клетки Huh-7.5 и MnHep подвергали заражению мышиным CD81-адаптированным HCVcc, и (C) уровни внутриклеточной и (D) внеклеточной РНК HCV анализировали, как описано выше. Три независимых эксперимента, каждый из которых выполнен в трех повторностях. *** П

См. это изображение и информацию об авторских правах в PMC

Цитируется

Прогресс, развитие терапевтических/диагностических подходов и проблемы в лечении инфекций, вызванных вирусом гепатита С.
Мешрам Р.Дж., Катвате Г.Х., Гачче Р.Н. Мешрам Р.Дж. и др. Арх Вирол. 2022 март; 167(3):717-736. doi: 10.1007/s00705-022-05375-0. Epub 2022 28 января. Арх Вирол. 2022. PMID: 35089390 Бесплатная статья ЧВК. Обзор.
Модели приматов, отличных от человека, для исследования механизмов связанных с инфекцией травм плода и детей, тератогенеза и мертворождения.
Ли М., Брокау А., Фурута А.М., Колер Б., Обрегон-Перко В., Чахруди А., Ван Х.И., Пермар С.Р., Хотчкисс К.Е., Голос Т.Г., Раджагопал Л., Адамс Уолдорф К.М. Ли М и др. Фронт Жене. 2021 5 июля; 12:680342. doi: 10.3389/fgene.2021.680342. Электронная коллекция 2021. Фронт Жене. 2021. PMID: 34290739 Бесплатная статья ЧВК. Обзор.
Животные модели, используемые в исследованиях вируса гепатита С.
Берггрен К.А., Судзуки С., Плосс А. Берггрен К.А. и соавт. Int J Mol Sci. 2020 29 мая; 21 (11): 3869. дои: 10.3390/ijms21113869. Int J Mol Sci. 2020. PMID: 32485887 Бесплатная статья ЧВК. Обзор.
Животные модели вирусной инфекции гепатита С.
Плосс А., Капур А. Плосс А и др. Колд Спринг Харб Перспект Мед. 2020 1 мая; 10(5):a036970. doi: 10.1101/cshperspect.a036970. Колд Спринг Харб Перспект Мед. 2020. PMID: 31843875 Бесплатная статья ЧВК. Обзор.
Различия между ортологами циклофилина А способствуют ограничению круга хозяев вируса гепатита С.
Гаска Дж.М., Балев М., Дин К., Хеллер Б., Плосс А. Гаска Дж. М. и соавт. Элиф. 2019 10 мая; 8:e44436. doi: 10.7554/eLife.44436. Элиф. 2019. PMID: 31074414 Бесплатная статья ЧВК.

Просмотреть все статьи «Цитируется по»

Типы публикаций

термины MeSH

вещества
Грантовая поддержка
- R00 AI077800/AI/NIAID NIH HHS/США
- P51 RR00016/RR/NCRR NIH HHS/США
- P51 RR000164/RR/NCRR NIH HHS/США
- P51 OD011104/OD/NIH HHS/США
- R01 HL098489/HL/NHLBI NIH HHS/США
- R56 AI091792/AI/NIAID NIH HHS/США
- R01 DK087867/DK/NIDDK NIH HHS/США
- R01 DK095125/DK/NIDDK NIH HHS/США
Полнотекстовые ссылки
Эльзевир Наука Бесплатная статья ЧВК
Процитируйте
Формат: ААД АПА МДА НЛМ
Отправить на
Клетки печени, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток макак-косичек, поддерживают инфекцию вирусом гепатита С
- Список журналов
- Рукописи авторов HHS
- PMC3805793
Гастроэнтерология. Авторская рукопись; доступно в PMC 2014 1 ноября.
Опубликовано в окончательной редакции как:
Гастроэнтерология. 2013 ноябрь; 145(5): 966–969.e7.
Published online 2013 Jul 25. doi: 10.1053/j.gastro.2013.07.026
PMCID: PMC3805793
NIHMSID: NIHMS510954
PMID: 23891978
, ^1, ^* , ^2, ^* , ¹ , ³ , ^{3 ,} ^{4 ,} ⁵ , ^{2 ,} ^** и ^{1 , ^{10010 ^**}}
Информация об авторе Информация об авторских правах и лицензии Отказ от ответственности
Дополнительные материалы
Узкая видовая тропность вируса гепатита С (ВГС) ограничивает исследования на животных. Мы обнаружили, что клетки печени макаки косички ( Macaca nemestrina ), полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, поддерживают весь жизненный цикл ВГС, хотя эффективность инфекции была ограничена дефектами в процессе проникновения клеток ВГС. Этот блок был преодолен путем либо увеличения экспрессии окклюдина, комплементации клеток человеческим CD81, либо инфицирования их штаммом HCV с менее ограниченной потребностью в CD81. Используя эту систему, мы можем изменить генетику вируса и клетки-хозяина, чтобы сделать макак с косичками подходящей, клинически значимой моделью для изучения инфекции ВГС.
Ключевые слова: животная модель, обезьяна, вирус гепатита С, репликация
Вирус гепатита С (ВГС) является причиной более половины всех случаев рака печени и большинства трансплантаций печени во всем мире ¹ . Вакцины против ВГС не существует, а лечение часто бывает неэффективным и осложняется побочными эффектами и резистентностью вируса ² . Известно, что ВГС естественным образом заражает только людей и шимпанзе (рассмотрено в ³). Из-за моратория на исследования шимпанзе и связанных с этим этических и финансовых проблем для изучения ВГС 9 необходима альтернативная животная модель. 0272 in vivo патогенеза и репликации, а также для разработки противовирусных препаратов и вакцин. Здесь мы стремились определить, поддерживают ли гепатоцитоподобные (MnHep) клетки, полученные из косичного макака ( Macaca nemestrina, Mn), репликацию ВГС, с конечной целью разработки иммунокомпетентной животной модели ВГС приматов, отличных от человека.
Несколько групп недавно показали, что индуцированные человеком плюрипотентные и эмбриональные стволовые клетки могут дифференцироваться в клетки печени, поддерживающие инфекцию ВГС ^4–7 . Мы использовали аналогичный подход для дифференциации клеток MnHep от индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (MniPSC) ⁸ (дополнительная фигура 1). Чтобы проверить их способность поддерживать инфекцию HCV, клетки MnHep и Huh-7.5 подвергали заражению инфекционным HCV, полученным в клеточной культуре (HCVcc; системы культивирования клеток HCV, рассмотренные в ⁹). Клетки MnHep поддерживали инфекцию и репликацию HCVcc, о чем свидетельствовали увеличение внутриклеточной РНК HCV с течением времени и окрашивание клеток гликопротеина HCV E2, оба из которых ингибировались ингибитором полимеразы HCV 2’C-метил-аденозином (2’CMA) ¹⁰ (). Однако этот процесс оказался неэффективным, так как уровни РНК ВГС в клетках MnHep были в 13,1 раза ниже, чем уровни, наблюдаемые в клетках Huh-7,5 человека положительного контроля. Следует отметить, что даже приближение к уровням инфицирования вирусом гепатита С Huh-7,5 является достижением, поскольку большинство систем с первичными культурами клеток допускают инфекции, которые значительно менее эффективны. Мы считаем, что клетки печени, полученные из стволовых клеток, просто лучше подходят для репликации ВГС, чем культивируемые первичные клетки. Действительно, недавно мы показали, что клетки печени, полученные из стволовых клеток человека, поддерживают инфекцию HCV с такой же эффективностью, как и клетки Huh-7.5 ¹¹ . Инфицированные ВГС клетки Huh-7.5 и MnHep секретировали пропорциональные количества РНК ВГС (), которые, как было показано, связаны с инфекционным вирусом на клетках Huh-7.5 (), а количество РНК ВГС, секретируемое клетками Huh-7.5 и MnHep, было пропорционально количество инфекционного вируса в последующих экспериментах по заражению. Таким образом, в то время как клетки MnHep поддерживают инфекцию HCV, по крайней мере один этап жизненного цикла вируса может быть неэффективным в этих клетках.
Открыть в отдельном окне
Клетки MnHep поддерживают инфекцию ВГС
Для оценки их способности поддерживать инфекцию ВГС клетки Huh7.5 и MnHep подвергали заражению ВГС дикого типа, который не кодирует репортерный ген. В указанное время после трансфекции (A) внутриклеточную и (B) внеклеточную РНК количественно определяли с помощью qRT-PCR. 2’CMA, ингибитор полимеразы ВГС, был включен в параллельные инфекции, чтобы продемонстрировать уровни РНК, независимые от репликации. Значения представляют собой количество копий РНК ВГС, определенное относительно стандартной кривой в зависимости от количества общей РНК для внутриклеточных образцов или объема супернатанта для внеклеточных образцов. (С) В 9Через 6 часов после инфицирования (h.p.i.) ложные или зараженные ВГС клетки, с 2’CMA или без него, подвергали иммуноокрашиванию на гликопротеин Е2 ВГС (красный) и контрастному окрашиванию Hoechst (синий). (D) Инфекционный ВГС в супернатантах, собранных при 48 л.с. определяли количественно с помощью анализа предельного разведения на клетках Huh-7.5 и выражали как инфекционную дозу 50% тканевой культуры на мл (TCID50/мл). Средние значения и стандартные отклонения трех независимых экспериментов, каждый из которых проводился в трех повторностях. *** P<0,001 (критерий Манна-Уитни)
Внедрение клеток ВГС является одной из стадий жизненного цикла вируса, влияющей как на тканевой, так и на видовой тропизм инфекции ВГС ¹² . Чтобы специально проверить их способность поддерживать проникновение клеток HCV, клетки MnHep и Huh-7.5 подвергали заражению лентивирусными частицами, несущими гликопротеины оболочки HCV (HCVpp), которые кодируют люциферазу Gaussia (GLuc) (рассмотрено в ⁹). После нормализации до параллельных инфекций VSVGpp для контроля незначительных различий в количестве клеток, MnHep (экспрессирующие только GFP в качестве отрицательного контроля) были в 7,9 раза менее инфицируемыми, чем клетки Huh-7,5 (). Важно отметить, что уровень проникновения в клетки MnHep зависел от подлинной функции гликопротеина ВГС, поскольку инфекция ингибировалась антителом, нейтрализующим гликопротеин Е2 ВГС ¹³ .
Открыть в отдельном окне
Клеточные и вирусные детерминанты способности клеток MnHep проникать в ВГС
Клетки MnHep, трансдуцированные для экспрессии только GFP, в качестве отрицательного контроля, или указанные факторы проникновения клеток ВГС подвергались заражению GLuc, экспрессирующим (A) HCVpp или (B) ВГСcc. Инфекции проводили параллельно с нейтрализующим антителом против ВГС (анти-Е2). Значения GLuc измеряли при 48 л.с. для HCVpp или указанные времена для HCVcc, нормализованные к параллельным инфекциям VSVGpp и установленные относительно инфекции клеток Huh-7.5 с высокой пермиссивностью. Три независимых эксперимента, каждый из которых выполнен с шестью повторами, и статистические данные относятся только к GFP. Наивные клетки Huh-7.5 и MnHep подвергали заражению мышиным CD81-адаптированным HCVcc, и (C) уровни внутриклеточной и (D) внеклеточной РНК HCV анализировали, как описано выше. Три независимых эксперимента, каждый из которых выполнен в трех повторностях. *** P<0,001 (критерий Манна-Уитни)
Из многих клеточных факторов, необходимых для проникновения клеток ВГС, четыре влияют на тропизм ВГС (рассмотрено в ¹⁴). Паттерны экспрессии типов клеток рецептора-мусорщика класса B типа I (SR-BI) и клаудина-1 (CLDN1) влияют на тропность этого процесса к тканям, в то время как различия в последовательностях CD81 и окклюдина (OCLN) влияют на тропизм видов. Все четыре из этих факторов были выражены в клетках MnHep (дополнительная фигура 2A-C). Сверхэкспрессия человеческих версий SR-BI и CLDN1 в этих клетках (контролируемая с помощью иммуноблота, дополнительная фигура 2E) не усиливала инфицирование HCVpp () или HCVcc (). Таким образом, Mn и человеческие версии этих белков были одинаково функциональны и присутствовали на уровнях насыщения. Сверхэкспрессия OCLN человека или Mn усиливала инфицирование репортером GLuc, экспрессирующим HCVpp и HCVcc (), что указывало на то, что уровни MnHep OCLN ограничивали проникновение HCV. Неудивительно, что белки OCLN обоих видов функционировали одинаково хорошо, поскольку последовательности, ранее определенные как критические для этой активности, схожи (дополнительная фигура 4A), и обе версии одинаково функционировали в клетках человека 786-O с дефицитом OCLN (дополнительная фигура 4B). . Сверхэкспрессия CD81 человека, но не Mn, усиливала инфекцию HCVpp и HCVcc в большей степени, чем избыточная экспрессия OCLN (14). Mn-версия CD81 идентична ортологу африканской зеленой мартышки (дополнительная фигура 5A), которая, как ранее было показано, демонстрирует 25% функции человеческого белка 9.0009 15 , и что мы подтвердили в клетках HepG2 человека (дополнительная фигура 5B). Котрансдукция человеческого, но не Mn CD81, с любой из версий OCLN еще больше усилила инфекцию HCVpp и HCVcc (2). Таким образом, неэффективное проникновение клеток MnHep HCV, вызванное низкими уровнями экспрессии OCLN и субоптимальной активностью предела Mn CD81, можно преодолеть с помощью генетических манипуляций с этими клетками.
Bitzegeio et al. недавно идентифицировали мутантный HCVcc, который эффективно использует белки CD81 как человека, так и мыши ¹⁶ . Этот вирус инфицировал клетки MnHep только в 3,9 раза менее эффективно, чем клетки Huh-7,5 (1), и эти клетки высвобождали пропорциональные уровни РНК ВГС (1). Таким образом, на основании наших данных о том, что HCVcc дикого типа инфицирует клетки MnHep в 13,1 раза менее эффективно, чем клетки Huh-7,5, адаптированный к CD81 вирус мыши инфицирует клетки MnHep в 3,4 раза лучше, чем HCVcc дикого типа ( P <0,001). Эти результаты показывают, что низкие уровни проникновения HCV, наблюдаемые в клетках MnHep, могут быть преодолены за счет генетической вирусной адаптации.
Таким образом, мы показываем, что клетки печени, полученные из MniPSCs, поддерживают инфекцию HCV, которая дополнительно усиливалась модификациями как вирусных, так и клеточных белков. Это важное открытие ставит под сомнение историческое предположение о том, что только клетки человека и шимпанзе восприимчивы к ВГС. Действительно, в предыдущем исследовании не удалось продемонстрировать инфицирование ВГС макак-резусов ¹⁷ . Возможно, что описанной выше блокировки входа было достаточно для предотвращения заражения в этом исследовании. Также возможно, что особенно сильная кинетика репликации штамма JFH-1, использованного в нашем исследовании, требовалась для наблюдаемого заражения клеток макак. Тем не менее, наше исследование предполагает, что макака с косичками действительно может быть подходящей моделью для изучения инфекции ВГС. Учитывая нынешнее ограничение исследований шимпанзе, разработка альтернативной клинически значимой модели, отличной от человека, имеет решающее значение для in vivo тестирование новых методов лечения ВГС. Наша система обеспечивает платформу для изучения взаимодействий ВГС-хозяин, которые влияют на эффективность заражения ВГС этих клеток, что должно привести к созданию более послушных моделей животных, отличных от человека.
01
Нажмите здесь для просмотра. ^{(2.5M, pdf)}
Поддержка грантов:
M.S. была поддержана докторской стипендией Робина Чемерса Нойстейна. Х.П.К. является исследователем молекулярной медицины Марки и лауреатом премии Хосе Каррераса/Э.Д. Thomas Chair for Cancer Research и гранты NIH R01 HL098489 и P51 RR00016. VGE была поддержана Институтом стволовых клеток черной семьи при Медицинской школе Икана на горе Синай. М.Дж.Э. был поддержан грантами NIH R01 DK095125, R00 AI077800 и R56 AI091792, грантом научного исследователя Американского онкологического общества (RSG-12-176-01-MPC) и благотворительным фондом Pew (MJE).
Раскрытие информации: нет
Помощь в написании: нет
Вклад авторов:
М.С., О.Г., Дж.Л.Г., Х.П.К., В.Г.Е. и М.Э. разработали исследование и эксперименты. М.С., О.Г. и В.Е. полученные и проанализированные данные. В.Г.Е. и ME составили рукопись, которую все авторы критически рассмотрели.
Отказ от ответственности издателя: Это PDF-файл неотредактированной рукописи, которая была принята к публикации. В качестве услуги нашим клиентам мы предоставляем эту раннюю версию рукописи. Рукопись будет подвергнута редактированию, набору текста и рецензированию полученного доказательства, прежде чем она будет опубликована в ее окончательной цитируемой форме. Обратите внимание, что в процессе производства могут быть обнаружены ошибки, которые могут повлиять на содержание, и все правовые оговорки, применимые к журналу, относятся к нему.
1. Браун Р.С., мл. Природа. 2005; 436: 973–78. [PubMed] [Google Scholar]
2. Marks KM, et al. Антивир Тер. 2012;17:1119–31. [PubMed] [Google Scholar]
3. Бух Ж. Гастроэнтерология. 2012; 142:1279–1287. е3. [PubMed] [Google Scholar]
4. Roelandt P, et al. J Гепатол. 2012; 57: 246–51. [PubMed] [Google Scholar]
5. Schwartz RE, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012;109:2544–8. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
6. Wu X, et al. PLoS Патог. 2012;8:e1002617. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
7. Yoshida T, et al. Biochem Biophys Res Commun. 2011; 416:119–24. [PubMed] [Google Scholar]
8. Zhong B, et al. Стволовые клетки Dev. 2011;20:795–807. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
9. Vieyres G, et al. Методы. 2013;59:233–248. [PubMed] [Google Scholar]
10. Carroll SS, et al. Дж. Биол. Хим. 2003; 278:11979–84. [PubMed] [Google Scholar]
11. Goldman O, et al. Клеточная стволовая клетка. 2013;12:748–60. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
12. Шулла А. и др. Карр Опин Вирол. 2012;2:725–32. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
13. Law M, et al. Нат Мед. 2008; 14:25–7. [PubMed] [Google Scholar]
14. Ploss A, et al. Природа. 2009; 457:882–6. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
15. Flint M, et al. Дж Вирол. 2006; 80: 11331–42. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
16.