Графические узоры по клеточкам для 1 класса: Рисунки узоров по клеточкам в тетради

Производство трехмерных стопок

Образцы FFPE были нарезаны на предметные стекла толщиной 3 мкм. Последовательно вырезали пять предметных стекол, оставляя интервал 80 мкм, затем вырезали следующие пять предметных стекол. Это повторялось на протяжении всего квартала. Первый слайд каждого среза окрашивали H&E, а второй слайд окрашивали на huCD45 в соответствии с протоколом, описанным выше.

Результаты

Модели NSCLC PDX сохраняют гистологические особенности опухоли пациента-донора

Панель моделей NSCLC PDX была основана на 14 первичных опухолях, охватывающих наиболее распространенные подтипы. Основные характеристики PDX и основная информация о пациенте-доноре перечислены в дополнительных онлайн-таблицах 3 и 4. Модели PDX сохраняли свой типичный гистопатологический вид во время серийного пассирования (n = 4) у мышей с ослабленным иммунитетом, визуально демонстрируя идентичные характеристики (рис. 1A). ). Мы подтвердили это наблюдение с помощью количественной оценки объективного класса тканей на репрезентативных сканах цельных слайдов H&E от пациентов-доноров и соответствующих PDX. Пропорции основных классов тканей опухоли, стромы и некроза сохраняются во время создания модели и оказались постоянными в отдельных моделях опухолей (рис. 1В).

Рисунок 1

(A) Гистологические особенности выбранного немелкоклеточного рака легкого PDX и соответствующей ткани пациента. Окрашивание гематоксилин-эозином готовили из фиксированных формалином залитых в парафин образцов ткани пациента-донора, а также из четвертого пассажа мышей NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ полученного из них PDX. Целые слайды были отсканированы, и из сканов были извлечены файлы JPEG с 10-кратным увеличением (включая масштабную линейку). (B) Алгоритм классификации тканей использовался для оценки процента классов тканей в пределах одного отсканированного предметного стекла, окрашенного гематоксилин-эозином. Для каждого пациента-донора (pt) и для каждого PDX анализировали одно окрашенное H&E изображение цельного предметного стекла. Результаты представлены в процентах от анализируемой площади. СА карцинома; LXFA, ксенотрансплантат рака легкого Фрайбург, аденокарцинома; LXFE, ксенотрансплантат рака легкого Фрайбург, эпителиальный; LXFL, ксенотрансплантат рака легкого Фрайбург, крупноклеточный; PDX, ксенотрансплантат, полученный от пациента.

Паттерн инфильтрации иммунными клетками является неотъемлемой чертой модели и может быть использован для классификации PDX-моделей НМРЛ на горячие и холодные опухоли

Мы оценили влияние имплантации опухоли на приживление иммунных клеток человека и наоборот Влияние иммунных клеток человека на рост опухоли. Анализы FC PB, BM и селезенки мышей с опухолью по сравнению с мышами без опухоли не выявили существенных различий между обеими группами (онлайн-дополнительная фигура 1A). И наоборот, присутствие иммунных клеток человека не изменяет рост, характерный для моделей NSCLC PDX. Это в качестве примера показано на дополнительном онлайн-рисунке 1B, где ксенотрансплантат рака легкого Фрайбурга, аденокарцинома (LXFA) 983 средний объем опухоли с течением времени представлен в NSG, Военно-морском медицинском исследовательском институте (NMRI) nu/nu и huNSG.

14 моделей PDX были имплантированы подкожно в huNSG (одна опухоль на модель на мышь), и иммунные клетки человека в опухоли, BM, селезенке и PB были количественно определены с помощью FC (рисунок 2A, онлайн-дополнительный рисунок 2A). Применяя порог 5% инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TIL), мы определили две группы, горячие и холодные опухоли, которые показывают очень значительную разницу в процентном соотношении TIL (p<0,00012). Сравнивая инфильтрацию иммунных клеток в различных системах органов между этими двумя группами, только фракция CD4 + в селезенке показала значительные различия (p<0,04). Соотношение CD4+/CD8+ в опухолевой ткани, как правило, было выше у мышей с холодовыми опухолями (незначительно (н.с.)). Примечательно, что в костном мозге и селезенке соотношение CD4+/CD8+ было значительно ниже при холодовых опухолях (онлайн-дополнительная фигура 2B, p<0,04). Следует отметить, что приживление иммунных клеток человека в PB до имплантации опухоли было сходным у отдельных мышей huNSG, получавших холодные или горячие опухоли (онлайн-дополнительная фигура 2C). Анализ FC одного образца на модель был репрезентативным для модели как таковой, как показано в независимых экспериментах для LXFA 9.83, LXFA 1674 и ксенотрансплантат рака легкого Freiburg, крупноклеточный (LXFL) 526 (онлайн-дополнительная фигура 2D).

Рисунок 2

(A) Анализ проточной цитометрией иммунных клеток человека в опухоли гуманизированных мышей NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ, когда объем опухоли достиг 400–500 мм³. Всего было проанализировано 14 животных с 14 различными моделями. Отдельные точки данных отображаются в виде диаграмм с минимумом и максимумом в виде усов, а медиана отображается в виде линии в рамке. Процент CD45+клеток в опухолевой ткани использовали в качестве критерия классификации на холодные (<5%) и горячие (>5%) опухоли соответственно. По этому критерию семь моделей были отнесены к группе холодных опухолей, а остальные семь – к группе горячих опухолей. (B) Уровни 38 человеческих и 23 мышиных цитокинов в опухолевой ткани горячих и холодных опухолей определяли для всех 14 моделей. Абсолютное значение пг белка/мг ткани нанесено на модель цитокина и опухоли. Жирным шрифтом выделены цитокины с более чем двукратным средним значением экспрессии в горячих опухолях по сравнению с холодными, подчеркнуты цитокины с более чем двукратным средним значением экспрессии в холодных опухолях по сравнению с горячими опухолями. Звездочки указывают статистическую разницу между группой холодных и горячих опухолей для определенного цитокина (критерий Манна-Уитни). (C) Влияние присутствия иммунных клеток человека в мышином хозяине определяли путем расчета кратности изменения 38 человеческих и 23 мышиных цитокинов в гуманизированных условиях по сравнению с негуманизированными для каждой модели и отображали в виде тепловой карты. Звездочки указывают статистическую разницу между группой негуманизированных и гуманизированных опухолей для определенного цитокина (критерий Манна-Уитни). G-CSF, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор; ГМ-КСФ, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор; ИФН, интерферон; ИЛ, интерлейкин; LXFA, ксенотрансплантат рака легкого Фрайбург, аденокарцинома; LXFE, ксенотрансплантат рака легкого Фрайбург, эпителиальный; LXFL, ксенотрансплантат рака легкого Фрайбург, крупноклеточный; TNF, фактор некроза опухоли.

Горячие и холодные опухоли демонстрируют специфический набор цитокинов человека

Горячие и холодные опухоли демонстрируют разные цитокиновые профили. Экспрессия четырех цитокинов человека более чем в два раза выше в холодных опухолях, тогда как экспрессия 17 цитокинов человека более чем в два раза выше в горячих опухолях, девять из них показывают статистически значимое различие. Только три мышиных цитокина активировались более чем в два раза в горячих опухолях и ни одного в холодных опухолях (все н.с., рис. 2В). Среди цитокинов человека с повышенной экспрессией в горячих опухолях были интерлейкин (IL)-16 и CXCL-13, которые, как известно, являются хемотаксическими для активированных Т-клеток. Кроме того, нейтрофилы, привлекающие цитокины CX3CL-1 и CXCL-6, были усилены наряду с провоспалительными цитокинами интерлейкином (IL)-2, IL-6 и гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (GM-CSF) (онлайн-дополнительная фигура 3) . Повышенные средние уровни экспрессии в холодовых опухолях сопровождались широким распространением, и поэтому их биологические последствия еще предстоит выяснить. Три мышиных цитокина с повышенной экспрессией IL-1a, Eotaxin и MIP-1a действительно оказывают провоспалительное действие, указывая на то, что мышиная часть микроокружения опухоли участвует в рекрутировании иммунных клеток человека (онлайн-дополнительная фигура 3). Влияние присутствия иммунных клеток человека в организме мыши-хозяина определяли путем расчета кратности изменения между негуманизированными и гуманизированными условиями на модель (рис. 2C) для человека, а также панель цитокинов мыши. Несколько мышиных цитокинов экспрессировались исключительно в присутствии иммунных клеток человека: Mo IL-2, Mo IL-5, Mo IL-10, Mo IL-17, Mo G-CSF, Mo GM-CSF. Кроме того, в большинстве моделей опухолей сильно активировалась другая группа мышиных цитокинов: Mo IL-6, Mo IL-9., Mo-IL-12, Mo IL-13, Mo интерферон (IFN)-γ, Mo цитокин, полученный из кератиноцитов (KC), Mo хемокин хематтракта моноцитов (MCP-1). Большинство этих цитокинов обладают провоспалительным эффектом. В явном виде описано, что IL-17 усиливает пролиферацию фибробластов и секрецию ими провоспалительных цитокинов. Тем не менее повышенная секреция IL-10 и IL-13 указывает на контррегуляцию гомеостаза иммунных клеток. В соответствии с этим наблюдалось подавление Mo IL-1a и b, Mo IL-3, Mo IL-4 и фактора некроза опухоли Mo (TNF)-α. Эффективность этого механизма регуляции можно увидеть, среди прочего, в сходных характеристиках роста отдельных моделей опухолей в отсутствие иммунных клеток человека на примере LXFA 9.83 (онлайн-дополнительный рисунок 1B). Экспрессия 24 из 38 цитокинов человека специфически или статистически значимо выше в присутствии иммунных клеток человека. Примечательно, что провоспалительные и частично противоопухолевые белки, такие как CXCL-13, IFN-γ, CCL8 и CXCL9, сильно активируются в присутствии иммунных клеток человека. Не наблюдалось различий между горячими и холодными опухолями в отношении регуляции цитокинов у мышей в зависимости от присутствия иммунных клеток человека.

Горячие и холодные опухоли характеризуются различными молекулярными особенностями

Сравнивая различные молекулярные характеристики в горячих и холодных опухолях, мы обнаружили сопоставимую мутационную нагрузку опухоли в обеих группах: 16,54 альтерации/МБ в горячих и 16,74 альтераций/МБ в холодных опухолях. Оценка EMT была в два раза выше при горячих опухолях (14,65 ± 0,72, холодные против 31,89 ± 0,52, горячие, нс). Что касается мутационного ландшафта моделей NSCLC PDX, горячие опухоли демонстрируют более высокую частоту мутаций в генах ERB2, KRAS и MET, тогда как холодные опухоли имеют более высокую частоту мутаций MYCL, PTEN, RB1 и TSC2. Исследование уровней экспрессии РНК одного и того же набора генов подтвердило более чем двукратные различия в средних уровнях экспрессии четырех генов: EGFR (р<0,005) и ROS1 (н.с.), тогда как MYCL (р<0,04) и MYCN (н.с.) показали более высокие уровни экспрессии в холодных опухолях (онлайн-дополнительная фигура 4).

Экспрессия белка PD-L1 на опухолевых клетках связана с плотностью инфильтрирующих иммунных клеток человека и huNSG соответственно (фиг. 3А). Влияние присутствия иммунных клеток человека определяли путем расчета кратности изменения площади DAB + в гуманизированных условиях по сравнению с негуманизированными на модель. В горячих опухолях было обнаружено более чем трехкратное увеличение экспрессии PD-L1.

Рисунок 3

Экспрессию PD-L1 определяли с помощью ИГХ в 14 различных PDX НМРЛ в присутствии или в отсутствие иммунных клеток человека. (A) Были подготовлены сканы всего слайда, и из сканов были извлечены репрезентативные файлы JPEG с 10-кратным увеличением (включая масштабную линейку). Количественная оценка экспрессии PD-L1, определенная с помощью IHC на панели из 14 моделей NSCLC PDX, семи холодных и семи моделей горячей опухоли. Площадь DAB + определяли с использованием программного обеспечения OSANO путем анализа одного предметного стекла на модель опухоли в присутствии и в отсутствие иммунных клеток человека (всего 28 стекол) (B). Влияние присутствия иммунных клеток человека в мышином хозяине было определяется путем расчета кратного изменения площади DAB + в гуманизированной по сравнению с негуманизированной установкой для каждой модели и отображается в виде тепловой карты. (C) Сравнение экспрессии PD-L1, представленной как относительная площадь DAB + (= процент анализируемой площади) на холодных и горячих опухолях. Отдельные точки данных отображаются в виде диаграмм с минимумом и максимумом в виде усов, а медиана отображается в виде линии в рамке. (D) С использованием полных изображений слайдов, окрашенных гематоксилин-эозином, процентное содержание классов тканей опухоли, стромы и некроза было измерено с помощью алгоритма классификации тканей в 14 моделях NSCLC PDX, размноженных в гуманизированных NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ, семи холодных и семи модели горячей опухоли. Результаты представлены в процентах от анализируемой площади. Для каждой модели анализировали одно полное сканирование предметного стекла (n=7 для холодных и горячих опухолей соответственно). Отдельные точки данных отображаются в виде диаграмм с минимумом и максимумом в виде усов, а медиана отображается в виде линии в рамке. (E) С использованием полных изображений слайдов, окрашенных гематоксилин-эозином, с помощью алгоритма классификации тканей был измерен процент тканей классов опухоли, стромы и некроза у 52 пациентов с образцами НМРЛ, 34 холодных и 18 горячих моделей опухолей. Результаты представлены в процентах от анализируемой площади. Для каждой модели анализировали одно полное сканирование предметного стекла (n=34 для холодных и n=18 для горячих опухолей соответственно). Отдельные точки данных отображаются в виде диаграмм с минимумом и максимумом в виде усов, а медиана отображается в виде линии в рамке. DAB, 3,3'-диаминобензидин; ИГХ, иммуногистохимия; LXFA, ксенотрансплантат рака легкого Фрайбург, аденокарцинома; LXFE, ксенотрансплантат рака легкого Фрайбург, эпителиальный; LXFL, ксенотрансплантат рака легкого Фрайбург, крупноклеточный; НМРЛ, немелкоклеточный рак легкого; PD-L1, лиганд 1 запрограммированной гибели клеток; PDX, ксенотрансплантат, полученный от пациента.

Холодные опухоли демонстрируют более высокое соотношение опухоль/строма, чем горячие опухоли

Мы определили распределение трех основных классов тканей: опухоли, стромы и некроза, в нашей панели NSCLC PDX. Во-первых, мы исследовали вариабельность распределения классов тканей по одному блоку. Мы проанализировали пять блоков различных необработанных моделей NSCLC PDX, следуя схеме, изображенной на дополнительном онлайн-рисунке 5A, и нанесли состав ткани на разные слайды (онлайн-дополнительный рисунок 5B). В качестве меры неоднородности по всему блоку мы сравнили среднее соотношение опухоль/некроз и среднее соотношение опухоль/строма одного предметного стекла со средним значением полного стека (дополнительная онлайн-таблица 6). Процентное соотношение опухоли и стромы в пределах одного предметного стекла было стабильным по всему блоку и специфичным для определенной модели опухоли. Напротив, процент некроза варьировал по всему блоку для некоторых моделей, а именно LXFL 1674 и ксенотрансплантата рака легкого Freiburg, эпителиальный (LXFE) 2324. И наоборот, увеличение некроза было связано с соответствующим уменьшением опухолевой ткани. Мы пришли к выводу, что срезы ткани для этого типа анализа предпочтительно должны быть приготовлены из центральных частей опухоли, так как эти области были с наименьшей дисперсией среди различных моделей.

После систематической оценки надежности нашего рабочего процесса мы исследовали одно целое изображение слайда (WSI) для каждого параметра из середины отдельного блока в последующих анализах. Сравнение состава ткани во всех 14 моделях показало, что опухолевая ткань представляет собой наиболее заметный класс тканей. Холодные опухоли отображали меньше стромы, чем горячие опухоли, что приводило к статистически значимой разнице между опухолью класса ткани и стромой, особенно в группе холодных опухолей (рисунок 3D, p<0,001). Следует отметить, что разница между содержанием стромы в холодных и горячих опухолях не была статистически значимой.

Соответствующий анализ был проведен на клинических образцах от 52 пациентов с НМРЛ. Подгруппирование холодных и горячих опухолей было построено на основе количественного определения CD45 + клеток на основе анализа изображений. В соответствии с анализом FC образцов, полученных из моделей PDX, разница между TIL в горячих и холодных опухолях была статистически значимой (онлайн-дополнительная фигура 5C, p<0,0001). Более того, состав ткани в клинических образцах был очень похож на состав, наблюдаемый на панели PDX. В соответствии с этим разница между классами тканей опухоли и стромы была более заметной в холодных опухолях по сравнению с горячими опухолями (рис. 3E, p<0,0001 и p<0,0025).

Холодные опухоли несколько более чувствительны к лечению ингибиторами контрольных точек, чем горячие опухоли

Оба ингибитора контрольных точек замедляли рост опухоли при монотерапии и комбинированной терапии в 14 моделях в разной степени (рис. 4А). Во всех моделях комбинированное лечение было наиболее эффективным, за ним следует только лечение антицитотоксическим Т-лимфоцит-ассоциированным белком 4 (CTLA-4) (p<0,012 и p<0,035 соответственно). Это справедливо при исследовании именно холодовых опухолей (p<0,024 и p<0,045 соответственно). Напротив, в группе горячих опухолей относительные объемы опухолей в разных группах лечения существенно не различались. Эти результаты были подтверждены изучением значений T/C в последний день эксперимента: во всех группах лечения три холодные, но только две горячие опухоли можно было определить как ответившие (значение T/C <50% частичной ремиссии, рисунок 4B). .

Рисунок 4

Чувствительность к лечению ингибиторами контрольных точек NSCLC PDX при монотерапии и комбинированной терапии была протестирована на 14 моделях NSCLC PDX в формате исследования на одной мыши. (A) Относительный объем опухоли в последний день эксперимента с объемом опухоли, измеренным в первый день лечения, установленным за 100%, был нанесен на график для различных групп лечения. Каждая точка представляет одно животное с другой моделью NSCLC PDX. Линия указывает медиану соответствующей группы. Статистические данные, выделенные темно-серым цветом, представляют собой анализ всех опухолей в группе лечения (горячее и холодное). (B) Тестовое/контрольное значение в последний день эксперимента было нанесено на график для каждой группы лечения отдельно для холодных и горячих опухолей. Каждая точка представляет одну опухоль. Линия указывает медиану соответствующей группы. Пунктирная линия отмечает тестовое/контрольное значение 50%, указывающее пороговое значение для ответившего по сравнению с неответившим. CTLA-4, цитотоксический белок 4, ассоциированный с Т-лимфоцитами; НМРЛ, немелкоклеточный рак легкого; PD-1, запрограммированная гибель клеток 1; PDX, ксенотрансплантат, полученный от пациента.

Лечение ингибиторами контрольных точек повышало уровень TIL преимущественно в холодных опухолях

При лечении ингибиторами контрольных точек популяция иммунных клеток увеличивалась в основном в холодных опухолях, тогда как в горячих опухолях наблюдалось менее выраженное увеличение инфильтрации иммунных клеток. Таким образом, разница в процентном содержании CD45+, определяющая горячие и холодные опухоли у нелеченых животных, была уменьшена до такой степени, что только в группе, получавшей анти-CTLA-4, это значение отражало статически значимую разницу (p<0,041, фигура 5A). ). Следует отметить, что в наиболее эффективной группе комбинированного лечения процент клеток CD45+/CD8+ был значительно выше в горячих опухолях (p<0,029)., множественные t-тесты). Чтобы лучше понять влияние лечения на инфильтрацию иммунных клеток, мы нанесли на график кратность изменений между необработанной и соответствующей группой лечения для различных типов иммунных клеток в холодных и горячих опухолях (рис. 5B). Стало очевидным, что, хотя различия в абсолютных значениях не были очевидны, именно холодовые опухоли демонстрировали заметное относительное увеличение инфильтратов иммунных клеток при лечении. Очевидно, активированные клетки CD4 + и CD8 +, а также соотношение CD4/CD8 были увеличены более чем в 100 раз в холодных опухолях. Параллельно лечение против запрограммированной клеточной гибели 1 (PD-1) снижало уровень CD45+клеток до 56% и активированных CD8+клеток до 59%.% необработанного контроля. Исследование кроветворных органов не выявило явных различий инфильтратов иммунных клеток человека во всех условиях (онлайн-дополнительный рисунок 6A, B).

Рисунок 5

(A) Анализ проточной цитометрией иммунных клеток человека в опухоли гуманизированных мышей NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ, несущих опухоль, в последний день эксперимента. В общей сложности 42 животных с 14 различными моделями ксенотрансплантатов, полученных от пациентов, были отнесены к разным группам лечения и проанализированы на предмет инфильтрации иммунными клетками человека. Отдельные точки данных отображаются в виде диаграмм с минимумом и максимумом в виде усов, а медиана отображается в виде линии в рамке. Разница между холодными и горячими опухолями была значимой для CD45 + в группе, получавшей изотипический контроль или лечение анти-CTLA-4, и для CD8 + клеток в группе комбинированного лечения (p<0,00013, p<0,041 и p<0,029)., множественные t-тесты). (B) Кратность изменения различных популяций иммунных клеток по сравнению с соответствующей необработанной контрольной группой была рассчитана для каждого отдельного эксперимента и модели. Средние значения кратности изменений для холодных и горячих опухолей были построены в виде тепловой карты. (C) Секреция цитокинов и хемокинов человека горячими и холодными опухолями при лечении различными CPi. Изменения кратности для холодных и горячих опухолей были нанесены на график в виде гистограммы со средним значением и SE среднего значения. Изменения кратности >2 выделены красным цветом, изменения кратности <0,5 выделены синим цветом. Для каждого аналита был проведен парный t-критерий отношения для определения статистической значимости между абсолютными значениями необработанного контроля и соответствующей группы лечения. (D) Уровни мышиного G-CSF в горячих опухолях при лечении различными CPi. Абсолютные значения мышиного G-CSF были построены в виде графика до и после для трех различных групп лечения. Для определения статистической значимости между абсолютными значениями необработанного контроля и соответствующей группы лечения был проведен парный t-критерий соотношения. CPi, ингибитор контрольной точки; CTLA-4, цитотоксический белок 4, ассоциированный с Т-лимфоцитами; G-CSF, фактор стимуляции колоний гранулоцитов; ИЛ, интерлейкин; ИФН, интерферон; PD-1, запрограммированная гибель клеток 1; TIL, опухоль-инфильтрирующие лимфоциты; TNF, фактор некроза опухоли.

Горячие и холодные опухоли демонстрировали явный набор цитокинов при лечении ингибиторами контрольных точек

Цитокины человека регулировались по-разному в зависимости от характеристик опухоли и группы лечения (рис. 5C). В холодных опухолях лечение анти-CTLA4 индуцировало повышенную регуляцию CXCL13, что, среди прочего, наблюдалось в группе горячих опухолей. Монотерапия анти-PD-1 не влияла на цитокиновый профиль холодовых опухолей человека. Напротив, наиболее эффективная комбинированная группа индуцировала активацию CCL17, CCL20 и CCL26 (все н.с.). В группе горячих опухолей монотерапия анти-CTLA-4 индуцировала увеличение экспрессии CXCL13 (p<0,037), а также повышение уровня CXCL9.(p<0,02) и MIF (н.с.). Напротив, лечение анти-PD-1 привело к снижению четырех цитокинов: CXCL9 (p<0,04), CXCL13 (p<0,047), CCL8 (p<0,04) и IL-16 (p<0,012). Лечение комбинированным ингибитором контрольной точки (CPi) приводило к увеличению CXCL9, CXCL10 и CXCL11 в опухолевой ткани (все н.с.). Экспрессия мышиного фактора стимуляции колоний гранулоцитов (G-CSF) была модулирована в группе горячих опухолей (фигура 5D). Лечение анти-CTLA-4 индуцировало повышение уровней G-CSF в горячих опухолях, что приводило к среднему кратному изменению в 2,6 раза для монотерапии и 3,4 в группе комбинированной терапии (все н. у.). На характер экспрессии других мышиных цитокинов лечение не оказало заметного влияния: кратность изменения колебалась от 0,6 до 1,9.(дополнительный онлайн рисунок 7).

Экспрессия PD-L1 модулируется обратно пропорционально в холодных и горячих опухолях при лечении ингибиторами контрольных точек -1 или их комбинация (фиг.6А). В целом, лечение CPi индуцировало повышение экспрессии PD-L1 в холодных опухолях, тогда как в горячих опухолях наблюдалось умеренное снижение экспрессии. Абсолютная экспрессия PD-L1 была значительно выше в горячих опухолях, чем в холодных опухолях необработанных рук (p

Рисунок 6

Экспрессию PD-L1 определяли с помощью ИГХ в 14 различных PDX НМРЛ в присутствии иммунных клеток человека и при лечении двумя различными ингибиторами контрольных точек при монотерапии и комбинированной терапии. Площадь DAB + определяли с использованием программного обеспечения OSANO путем анализа одного цельного предметного стекла на модель опухоли и настройки: гуманизированное необработанное, гуманизированное лечение анти-CTLA-4, гуманизированное лечение анти-PD-1 и гуманизированное комбинированное лечение, всего 56 слайдов. (A) Репрезентативные файлы JPEG с 10-кратным увеличением были извлечены из сканов (включая масштабную линейку) для одной холодной и одной горячей модели опухоли в разных группах лечения. (B) Кратность изменения экспрессии PD-L1 по сравнению с соответствующим необработанным контролем рассчитывали для каждой модели и наносили на график отдельно для холодных и горячих опухолей. Отдельные точки данных отображаются в виде диаграмм с минимумом и максимумом в виде усов, а медиана отображается в виде линии в рамке. Пунктирная линия a y=1 изображает точку перегиба от понижения (<1) к повышению (>1) PD-L1. (C) Абсолютные значения экспрессии PD-L1, представленные как относительная площадь DAB + (= процент анализируемой площади) в различных группах лечения, были нанесены отдельно для холодных и горячих опухолей. Отдельные точки данных отображаются как графики скрипки с отдельными точками данных. (D) С использованием полных изображений предметных стекол, окрашенных гематоксилин-эозином, процентная доля опухолей, стромы и некроза классов тканей была измерена с помощью алгоритма классификации тканей в 14 моделях NSCLC PDX. Классы тканей для холодных и горячих опухолей в различных группах лечения представлены в процентах от анализируемой площади. Для каждой модели и каждой лечебной группы было проанализировано одно полное сканирование предметного стекла (n=7 для холодных и горячих опухолей соответственно). Отдельные точки данных отображаются в виде диаграмм с минимумом и максимумом в виде усов, а медиана отображается в виде линии в рамке. CTCLA-4, цитотоксический белок 4, ассоциированный с Т-лимфоцитами; DAB, 3,3'-диаминобензидин; LXFA, ксенотрансплантат рака легкого Фрайбург, аденокарцинома; PD-1, запрограммированная гибель клеток 1; PD-L1, лиганд 1 запрограммированной гибели клеток; НМРЛ, немелкоклеточный рак легкого; PDX, ксенотрансплантат, полученный от пациента.

Распределение трех основных классов тканей было изменено при лечении CPi

Лечение CPi’ оказало различное влияние на долю трех основных классов тканей опухоли, стромы и некроза. В холодных опухолях соотношение между тремя классами было стабильным во всех группах лечения. В горячих опухолях лечение анти-CTLA-4 уменьшало содержание стромы, увеличивая процент площади опухоли. Кроме того, лечение анти-PD-1 вызывало уменьшение некроза, что также верно для комбинированного лечения (рис. 6D).

Обнаружение TIL на основе IHC с использованием анализа изображения всего предметного стекла отражает результаты FC тестирования SMT

Чтобы дополнить наш набор данных с использованием клинически значимой технологии, мы определили инфильтрацию CD45 + клеток человека с помощью IHC. Как и при количественной оценке класса ткани, мы исследовали гетерогенность инфильтрата иммунных клеток на протяжении одного блока в пяти репрезентативных моделях NSCLC PDX. В качестве меры гетерогенности по блоку мы нанесли на график средний процент (±SD) иммунных клеток на предметных стеклах по сравнению со средним процентом (±SD) всего блока. Несмотря на LXFE 2324, среднее значение отдельного предметного стекла находилось в пределах стандартного отклонения всего стека (рис. 7А). Опять же, после этапа проверки мы исследовали один WSI для каждой настройки во всех последующих анализах. Сравнение процентной доли площади DAB + ядра в качестве показателя инфильтратов иммунных клеток подтвердило данные FC 14 моделей NSCLC PDX (рис. 7B). Разница в инфильтратах иммунных клеток между холодными и горячими опухолями была статистически значимой в необработанной ткани. В частности, при лечении анти-PD-1 разница между двумя группами стала менее заметной. По аналогии с данными FC мы сравнили кратное изменение инфильтратов иммунных клеток человека в различных группах лечения при холодовых и горячих опухолях (рис. 7C). Хотя изменения были более тонкими по сравнению с анализом FC, тенденция была очень похожей: инфильтраты иммунных клеток увеличивались в первую очередь в холодных опухолях при лечении ингибиторами контрольных точек, в то время как они оставались стабильными или даже уменьшались в горячих опухолях.

Рисунок 7

С использованием изображений цельных слайдов иммуногистохимических препаратов, окрашенных DAB против CD45, присутствие CD45+клеток на слайде определяли количественно как процент площади ядер, положительных по DAB, от общей площади ядер. (A) Для пяти образцов из необработанного ксенотрансплантата, полученного от пациента с немелкоклеточным раком легкого, был проанализирован полный пакет, как описано в M&M, и был нанесен средний процент и стандартное отклонение частичных пакетов по сравнению со средним процентом и стандартным отклонением полного пакета. (B) Процент окрашенной DAB CD45-положительной области по отношению к полной площади образца для холодных и горячих опухолей в различных группах лечения нанесен как процент анализируемой площади. Для каждой модели и каждой лечебной группы было проанализировано одно полное сканирование предметного стекла (n=7 для холодных и горячих опухолей соответственно). Отдельные точки данных отображаются в виде диаграмм с минимумом и максимумом в виде усов, а медиана отображается в виде линии в рамке. (C) Кратность изменения инфильтрации CD45 + клеток, определяемая процентом площади DAB +, по сравнению с соответствующей необработанной контрольной группой, рассчитывалась для каждого отдельного эксперимента и модели. Средние значения кратности изменений для холодных и горячих опухолей были построены в виде тепловой карты. CTLA-4, цитотоксический белок 4, ассоциированный с Т-лимфоцитами; DAB, 3,3'-диаминобензидин; LXFA, ксенотрансплантат рака легкого Фрайбург, аденокарцинома; LXFE, ксенотрансплантат рака легкого Фрайбург, эпителиальный; LXFE, ксенотрансплантат рака легкого Фрайбург, эпителиальный.

Обсуждение

Появление иммуноонкологии произвело революцию в лечении рака. опухоли и их микроокружение. Идентификацию потенциальных маркеров стратификации, оценку возможных комбинированных терапий и идентификацию новых мишеней необходимо начинать в доклиническом периоде. Хотя сингенные модели обладают неоспоримыми преимуществами, потребность в модели in vivo, экспрессирующей специфические для человека мишени в перекрестных помехах с иммунными клетками человека, является необходимостью. как два золотых стандарта для онкологии и иммунологии. На панели из 14 NSCLC PDX можно было идентифицировать горячие и холодные опухоли, сходные с клиническими условиями.29В соответствии с данными клинических исследований у пациентов с НМРЛ было обнаружено, что подтипы Т-клеток демонстрируют очень похожее распределение в обоих классах. 30 Интересно, что процент естественных клеток-киллеров был одинаково низким в холодных и горячих опухолях, что также имитировало клиническую картину. ситуация (рис. 2A).31, 32 Кроме того, пять из семи биомаркеров были по-разному экспрессированы в горячих и холодных опухолях: уровни цитокинов (рис. 2B), экспрессия PD-L1 и соотношение опухоль/строма (рис. 3), оценка EMT (онлайн дополнительная фигура 4) и васкуляризация (дополнительная онлайн-таблица 4). Терапевтический эксперимент в формате SMT выявил характер ответа, очень сравнимый с клиникой (рис. 4).24, 33 Ни один из исследованных биомаркеров не был предиктором лечения CPi. Тем не менее, модели опухолей продемонстрировали уникальную характеристику при лечении в зависимости от их скорости TIL (рис. 5–7). Опять же, это отражает клиническую ситуацию, когда прогностический биомаркер еще не определен, и наблюдается тенденция к определению исключающих биомаркеров, связанных с отсутствием пользы и/или риском побочных эффектов.1, 2, 34, 35 Интеграция различных показаний является одним из преимуществ. доклинических условий, чтобы улучшить возможность раннего выявления прогностических биомаркеров.

Способность панелей PDX отражать картину болезни хорошо описана нами и другими группами. иначе описательный признак. Тот факт, что FC в качестве золотого стандарта в доклинической онкологии и анализ изображений WSI в качестве считывания, применимого в рутинной клинической диагностической обстановке, привел к тем же выводам, что подчеркивает трансляционную ценность платформы. Трансляционное значение самого инструмента анализа изображений было подтверждено на панели образцов НМРЛ человека из несвязанной когорты, что подтвердило надежность алгоритма глубокого обучения (рис. 3E, дополнительная онлайн-рис. 5C). Хотя значимость показателя TIL как прогностического маркера восприимчивости к лечению ХПН еще предстоит полностью выяснить,38 тот факт, что первый показатель может быть определен как имманентный признак модели, аналогичный молекулярному строению или гистологической архитектуре конкретного PDX. подтверждает роль этих моделей в качестве золотого стандарта в условиях иммуноонкологии. Лечение ИПН превратило иммунологически «холодные» опухоли в «горячие», что объясняет более высокую чувствительность к лечению в первой группе. Повышенная активность комбинированного лечения CPi является убедительным показателем, подтверждающим это предположение.23 Остается выяснить, могут ли «холодные» опухоли, определенные в этом исследовании на основе плотности TIL, состоять из смеси «холодных», «иммунных» исключены» и «опухоли с иммуносупрессией/иммунной пустыней».

Использование моделей PDX неизбежно ставит вопрос о том, как справиться с внутриопухолевой гетерогенностью.5 39 В нашем исследовании мы определили степень гетерогенности в пределах одной опухоли путем анализа распределения трех основных классов тканей и распределения CD45+ по всему образцу опухоли (рис. 7, дополнительная онлайн-рис. 5B). Эта стратегия валидации позволяет использовать PDX в доклинических исследованиях ввода-вывода и повышает надежность маркеров IHC в качестве поступательного считывания в доклинических исследованиях. Поскольку большая часть сопутствующей диагностики для стратификации пациентов основана на ИГХ, это подразумевает стратегическое преимущество, позволяющее облегчить переход инновационных препаратов из доклинического пространства в раннее клиническое. надежность системы зависит не только от характеристик модели, но и от целевого паттерна экспрессии.40, 41,

Насколько нам известно, это первый случай систематической оценки осуществимости SMT в иммуноонкологических условиях с использованием инструментов компьютерной патологии, интегрированных с иммунологическим (цитокиновым) профилированием. 12 Преимущества этого формата скрининга вступили в силу. при тестировании иммуномодулирующих соединений в такой же степени, как описано выше для традиционных онкологических препаратов.42 Первоначально разработанная как платформа для скрининга in vivo,4 SMT в сочетании с функциональными показаниями может обеспечить механистическое понимание механизма действия и поддержать разработку прогностические биомаркеры. Тот факт, что не было прямой корреляции между уровнем экспрессии PD-L1 в опухолевой ткани и чувствительностью к лечению CPi, согласуется с наблюдениями клинических групп, которые стремятся разработать биомаркеры для стратификации пациентов с НМРЛ и другими типами рака.2,43– 45

Использование больших панелей цитокинов для функционального анализа оказалось очень многообещающим. Увеличение CCL26 при наиболее эффективном комбинированном лечении, скорее всего, может быть связано с усилением гипоксии, поскольку клетки, экспрессирующие этот хемокин независимо от гипоксии, отсутствуют в модели huNSG. 46 Эта гипотеза дополнительно подтверждается тем фактом, что процент некроза особенно увеличивается при холодовых опухолях в группе комбинированного лечения. Биологические последствия повышенных уровней CXCL13 при лечении CTLA-4 не могут быть полностью выяснены, поскольку компартмент супрессорных клеток миелоидного происхождения, являющийся мишенью для этого хемокина, сильно недопредставлен в модели huNSG (рис. 5C,D).47 При параллельной оценке уровней цитокинов мыши и человека можно было различать цитокины, полученные из опухолевых или иммунных клеток человека, и из микроокружения опухоли, отличной от человека. Видоспецифичность соответствующих платформ позволила устранить эту очень сложную взаимосвязь.48–50 Хотя знания о перекрестной реактивности цитокинов человека и мыши и их рецепторов фрагментарны, важно подробно охарактеризовать животную модель. При систематическом анализе моделей мышей в различных условиях интерпретация результатов приобретет трансляционную ценность.51, 52,

В совокупности успешная разработка биомаркеров для иммуноонкологии требует глубокого понимания механизма и понимания экспрессии биомаркеров в контексте механизма действия. Модели PDX в huNSG обладают высоким потенциалом для устранения этого разрыва между доклиническими испытаниями эффективности и клинической разработкой ранней сопутствующей диагностики.

Заявление о доступности данных

Полное секвенирование экзома, секвенирование РНК и отсканированные изображения доступны в общедоступном хранилище с открытым доступом. Запрос алгоритма анализа изображения предоставляется по обоснованному запросу. Все данные, непосредственно относящиеся к исследованию, включены в статью или загружены в качестве дополнительной информации. Данные RNASeq и целого экзома Seq доступны через https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra, данные изображений модели PDX доступны через IDR (https://idr.openmicrooscopy.org/tissue/). Все дополнительные данные, относящиеся к исследованию, либо загружаются в качестве дополнительной информации, либо могут быть запрошены у старших авторов JS (модели животных), FF (цифровая и обычная патология) или DM (цифровая патология/анализ изображений).

Благодарности

Мы благодарим Николь Кронке за отличную техническую помощь и Хагена Клетта за ИТ-поддержку.

Каталожные номера

1. ↵
   1. Camidge DR,
   2. Doebele RC,
   3. Kerr KM

   . Сравнение и противопоставление прогностических биомаркеров для иммунотерапии и таргетной терапии НМРЛ. Nat Rev Clin Oncol 2019;16:341–55.doi:10.1038/s41571-019-0173-9pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30718843

2. ↵
   1. Ким Х.,
   2. Квон Х.Дж.,
   3. Ким Э.С. и др.

   . Сравнение прогностической способности комбинированного и индивидуального тестирования биомаркеров у пациентов с немелкоклеточным раком легкого, получавших ингибиторы иммунных контрольных точек. Противораковая терапия 2021:583.doi:10.4143/crt.2021.583pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/34237208

3. ↵
   ,
   2. Tan32 Tantler JJ,
   3. Weekes CD и др.

   . Опухолевые ксенотрансплантаты, полученные от пациентов, как модели для разработки онкологических препаратов. Nat Rev Clin Oncol 2012;9:338–50.doi:10.1038/nrclinonc.2012.61pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22508028

4. ↵
   1. Мильярди Г.,
   2. Галими Ф. и др.

   . Молекулярно аннотированная платформа ксенотрансплантатов, полученных от пациентов («ксенопациенты»), идентифицирует HER2 как эффективную терапевтическую мишень при цетуксимаб-резистентном колоректальном раке. Рак Discov 2011;1:508–23.doi:10.1158/2159-8290.CD-11-0109pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22586653

   1. ↵
   2. 4
      Бруна А.,
      1. Руэда О.М.,
      2. Гринвуд В. и др.

      . Биобанк эксплантатов рака молочной железы с сохраненной внутриопухолевой гетерогенностью для скрининга противоопухолевых соединений. Cell 2016;167:260–74.doi:10.1016/j.cell.2016.08.041pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27641504

   3. ↵
      1. Идальго М.,
      2. Амант Ф.,
      3. Бьянкин А.В. и др.

      . Модели ксенотрансплантатов пациентов: новая платформа для трансляционных исследований рака. Cancer Discov 2014;4:998–1013.doi:10.1158/2159-8290.CD-14-0001pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25185190

   4. ↵
   5. 4 Conte N,
   6. Mason JC,
   7. Halmagyi C, и др.

   . Поиск PDX: портал для обнаружения модели ксенотрансплантата опухоли, полученной от пациента. Nucleic Acids Res 2019;47:D1073–9.doi:10.1093/nar/gky984pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30535239

5. ↵ 5

   Gao Korn JM,

   1. Ferretti S, и др.

   . Высокопроизводительный скрининг с использованием ксенотрансплантатов опухолей, полученных от пациентов, для прогнозирования ответа на лекарственные препараты в клинических испытаниях. Nat Med 2015;21:1318–25.doi:10.1038/nm.3954pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26479923

6. ↵
   1. Pan E,
   2. Богумил D,
   3. Cortessis V и др.

   . Систематический обзор эффективности доклинических моделей лекарств от рака легких. Front Oncol 2020; 10: 591.doi: 10.3389/fonc.2020.00591PMID: http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/323

7. etshmed/323

8. ↵

   3

13

3

3

3

3

3

3

3

3

3

3

3

3

3

. Трансляционное исследование: 4 способа исправить клиническое исследование.

Nature 2011;477:526–8.doi:10.1038/477526apmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21956311
9. ↵
   1. Маллард А

   . 2013 год в размышлениях. Nat Rev Drug Discov 2014;13:5–7.doi:10.1038/nrd4218pmid:http://www.ncbi.nlm. nih.gov/pubmed/24378784

10. ↵
    1. De La Rochere2,
    2. Guil-Luna S,
    3. Decaudin D и др.

    . Гуманизированные мыши для изучения иммуноонкологии. Trends Immunol 2018;39:748–63.doi:10.1016/j.it.2018.07.001pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30077656

11. ↵
    1. Капассо А,
    2. Ланг Дж.,
    3. Питтс ТМ и др.

    . Характеристика иммунных ответов на моно- и комбинированную иммунотерапию против PD-1 у гемопоэтических гуманизированных мышей с имплантированными опухолевыми ксенотрансплантатами. J Immunother Cancer 2019;7:37.doi:10.1186/s40425-019-0518-zpmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30736857

12. ↵
    Rongvaux A,
    1. Такидзава Х.,
    2. Стровиг Т. и др.

    . Мыши с гемато-лимфоидной системой человека: текущее использование и будущий потенциал для медицины. Annu Rev Immunol 2013; 31: 635–74. M,

13. Yao LC,
14. Cheng M, и др.

. Гуманизированные мыши в изучении эффективности и механизмов иммунотерапии рака, нацеленного на PD-1. Фасеб Дж. 2018; 32: 1537–49.doi: 10.1096/fj.201700740rpmid: http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2

34

. Сопутствующая и дополнительная диагностика сосредоточена на анализе экспрессии PD-L1 для ингибиторов контрольной точки PD-1/PD-L1 при немелкоклеточном раке легкого. Ther Drug Monit 2018;40:9–16.doi:10.1097/FTD.0000000000000460pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/231

0 Khan Хан С. А.,

. Иммунная дисрегуляция у онкологических больных с развитием побочных эффектов, связанных с иммунитетом. Br J Рак 2019;120:63–8.doi:10.1038/s41416-018-0155-1pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30377338

. Инновации, проблемы и минимум информации для стандартизации гуманизированных мышей. EMBO Mol Med 2020;12:e8662.doi:10.15252/emmm.201708662pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32578942

. Многопараметрическое профилирование немелкоклеточного рака легкого выявляет различные иммунофенотипы. JCI Insight 2016;1:e89014.doi:10.1172/jci.insight.89014pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27699239

. Естественные клетки-киллеры в микроокружении опухоли легкого человека проявляют иммуноингибирующие функции. J Immunother Cancer 2020;8:e001054.doi:10.1136/jitc-2020-001054pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/33067317

. Анализ многоспектральных изображений с помощью платформы AstroPath сообщает об эффективности блокады PD-1. Science 2021;372:2609.doi:10.1126/science.aba2609pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/34112666

. Гипоксия индуцирует рекрутирование супрессорных клеток миелоидного происхождения в гепатоцеллюлярную карциному через хемокиновый (мотив C-C) лиганд 26. Hepatology 2016;64:797–813.doi:10.1002/hep.28655pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27228567

. Доклинические исследования: заставьте исследования на мышах работать. Nature 2014;507:423–5.doi:10.1038/507423apmid:http://www.ncbi. nlm.nih.gov/pubmed/24678540

Дополнительные материалы

• Дополнительные данные

  Этот веб-файл был создан BMJ Publishing Group из электронного файл, предоставленный автором (авторами) и не подвергавшийся редактированию.

  • Дополнение к данным 1
  • Дополнение к данным 2
  • Дополнение к данным 3
  • Дополнение к данным 4
  • Дополнение к данным 5
  • Дополнение к данным 6
  • Дополнение к данным 7
  • Дополнение к данным 8
  • Дополнение к данным 9
  • Дополнение к данным 10

Сноски

• Участники Концептуализация: EO, DB, AG, DM, FF и JS. Методология: EO, DB, AG, SG, GN, DM, FF и JS. Валидация: KL, AE и KK. Формальный анализ: EO, DB, KL, AE и JS. Ресурсы: GN, DM, FF и JS. Курирование данных: EO, DB, AG, NB, DL, AL, AB, VK, AE, KK и SG. Написание, подготовка первоначального проекта: EO, AG и JS. Написание, рецензирование и редактирование: DM и FF. Визуализация: БД, АГ и НБ. Надзор: DM, FF и JS. Администрация проекта: JS. Получение финансирования: DM, FF и JS. Гарант: JS

• Финансирование Это исследование финансировалось Министерством образования и исследований Германии (BMBF; разрешение № 031B0006A-C).

• Конкурирующие интересы Не заявлено.

• Происхождение и рецензирование Не введен в эксплуатацию; рецензируется внешними экспертами.

• Дополнительный материал Содержание предоставлено автором(ами). Он не был проверен BMJ Publishing Group Limited (BMJ) и, возможно, не прошел рецензирование. Любые обсуждаемые мнения или рекомендации принадлежат исключительно авторам и не поддерживаются BMJ.