Графические узоры по клеточкам для 1 класса: Рисунки узоров по клеточкам в тетради

1. Пятилетняя биохимическая вероятность безрецидивного прогрессирования для групп радикальной простатэктомии 1-5 составила 96%, 88%, 63%, 48 % и 26%.
   
2. Группы 5 степени также были прогностическими для степени биопсии с последующей радикальной простатэктомией или лучевой терапией.
3. Новая система сводит степени рака предстательной железы к наименьшему числу степеней, каждая из которых имеет уникальный прогноз. В результате существенных различий в критериях и отчетах по сравнению с исходной системой оценок Глисона мы рассмотрели вновь предложенные группы оценок как новую систему оценок.

Новая система классификации рака предстательной железы имеет очевидные преимущества:

1. Более точная стратификация оценок по сравнению с существующей системой Глисона
2. Упрощенная система оценок из 5 вместо нескольких возможных баллов в зависимости от различных комбинаций шаблонов Глисона
3. Самая низкая оценка — 1, в отличие от текущей практики оценки по шкале Глисона 6, с потенциалом снижения чрезмерного лечения вялотекущего рака простаты

Новая система оценок с использованием приведенной выше терминологии была принята Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) в 2016 году.

Во избежание путаницы будет разумно сообщать о новой системе оценивания в сочетании с системой Глисона до тех пор, пока она не станет широко принятой и практикуемой [т.е. Оценка по Глисону 3+3=6 (Группа 1) ].

Эпштейн Дж.И., Зелефски М.Дж., Шоберг Д.Д. и др. Современная система классификации рака простаты: проверенная альтернатива шкале Глисона. Евр Урол (2015).

Загрузить PDF-версию

Руководство по управляемой кластеризации • Seurat

• Установить
• Начать
• Виньетки
• Расширения
• Часто задаваемые вопросы
• Новости
• Ссылка
• Архив

Составлено: 11 января 2022 г.

Источник: vignettes/pbmc3k_tutorial.Rmd

pbmc3k_tutorial. Rmd

Для этого руководства мы будем анализировать набор данных мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), свободно доступный в 10X Genomics. На Illumina NextSeq 500 секвенировано 2700 отдельных клеток. Необработанные данные можно найти здесь.

Начнем со чтения данных. Функция Read10X() считывает выходные данные конвейера cellranger из 10X, возвращая уникальную матрицу молекулярного идентифицирования (UMI). Значения в этой матрице представляют собой количество молекул для каждого признака (т. е. гена; строки), обнаруженных в каждой ячейке (столбце).

Затем мы используем матрицу количества для создания объекта Seurat . Объект служит контейнером, который содержит как данные (например, матрицу подсчета), так и анализ (например, PCA или результаты кластеризации) для набора данных с одной ячейкой. Для технического обсуждения структуры объекта Seurat ознакомьтесь с нашей GitHub Wiki. Например, матрица подсчета хранится в pbmc[["RNA"]]@counts .

 библиотека (dplyr)
библиотека (Сера)
библиотека (пэчворк)
# Загрузите набор данных PBMC
pbmc.data <- Read10X(data.dir = "../data/pbmc3k/filtered_gene_bc_matrices/hg19/")
# Инициализировать объект Seurat необработанными (ненормализованными данными).
pbmc <- CreateSeuratObject(counts = pbmc.data, project = "pbmc3k", min.cells = 3, min.features = 200)
pbmc 

 ## Объект класса Сера
## 13714 признаков для 2700 образцов в рамках 1 анализа
## Активный анализ: РНК (13714 признаков, 0 переменных признаков) 

Как выглядят данные в матрице подсчета?

 # Давайте проверим несколько генов в первых тридцати клетках
pbmc.data[c("CD3D", "TCL1A", "MS4A1"), 1:30] 

 ## Разреженная матрица 3 x 30 класса "dgCMatrix"
##
## CD3D 4 . 10 . . 1 2 3 1 . . 2 7 1 . . 1 3 . 2 3 . . . . . 3 4 1 5
## TCL1A . . . . . . . . 1 . . . . . . . . . . . . 1 . . . . . . . .
## MS4A1 . 6 . . . . . . 1 1 1 . . . . . . . . . 36 1 2 . . 2 . . . . 

. 90 600 значений в матрице представляют собой 0 (молекулы не обнаружены). Поскольку большинство значений в матрице scRNA-seq равны 0, Сёра по возможности использует представление разреженной матрицы. Это приводит к значительной экономии памяти и скорости для данных Drop-seq/inDrop/10x.

 плотно.размер <- object.size(as.matrix(pbmc.data))
плотный.размер 

 ## 7095
 байт 

 sparse.size <- object.size(pbmc.data)
разреженный.размер 

 ## 29
2 байт 

 плотный.размер/разреженный.размер 

 ## 23,7 байта 

Приведенные ниже шаги охватывают стандартный рабочий процесс предварительной обработки данных scRNA-seq в Seurat. Они представляют собой выбор и фильтрацию клеток на основе показателей контроля качества, нормализацию и масштабирование данных, а также обнаружение сильно изменчивых признаков.

Seurat позволяет легко просматривать метрики контроля качества и фильтровать ячейки на основе любых пользовательских критериев. Несколько показателей контроля качества, обычно используемых сообществом, включают

• Количество уникальных генов, обнаруженных в каждой клетке.
  • Клетки низкого качества или пустые капли часто содержат очень мало генов
  • Дублеты или мультиплеты клеток могут демонстрировать аберрантно высокое количество генов
• Точно так же общее количество молекул, обнаруженных в клетке (сильно коррелирует с уникальными генами)
• Процент прочтений, которые сопоставляются с митохондриальным геномом
  • Низкокачественные/отмирающие клетки часто обнаруживают обширное митохондриальное загрязнение
  • Мы рассчитываем метрики контроля качества митохондрий с помощью функции PercentageFeatureSet() , которая вычисляет процент отсчетов, происходящих из набора признаков
  • Мы используем набор всех генов, начиная с MT-, как набор митохондриальных генов

 # Оператор [[ может добавлять столбцы в метаданные объекта. MT-") 

Где в Seurat хранятся показатели контроля качества?

• Количество уникальных генов и общее количество молекул автоматически рассчитывается во время CreateSeuratObject()
  • Вы можете найти их в метаданных объекта

 # Показать метрики контроля качества для первых 5 ячеек
руководитель ([email protected], 5) 

 ## orig.ident nCount_RNA nFeature_RNA процент.mt
## AAACATACAACCAC-1 pbmc3k 2419 7793.0177759
## AAACATTGAGCTAC-1 pbmc3k 4903 1352 3,7935958
## AAACATTGATCAGC-1 pbmc3k 3147 1129 0,8897363
## AAACCGTGCTTCCG-1 pbmc3k 2639 960 1.7430845
## AAACCGTGTATGCG-1 pbmc3k 980 521 1.2244898 

В приведенном ниже примере мы визуализируем показатели контроля качества и используем их для фильтрации ячеек.

• Мы фильтруем ячейки с числом уникальных признаков более 2500 или менее 200
• Мы фильтруем клетки с количеством митохондрий >5%

 # Визуализируйте показатели контроля качества в виде скрипичного графика
VlnPlot(pbmc, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent. mt"), ncol = 3) 

 # FeatureScatter обычно используется для визуализации отношений между признаками, но может использоваться
# для всего, что рассчитывается объектом, т. е. столбцов в метаданных объекта, оценок ПК и т. д.
plot1 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "percent.mt")
plot2 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "nFeature_RNA")
участок1 + участок2 

 pbmc <- subset(pbmc, subset = nFeature_RNA > 200 и nFeature_RNA < 2500 и процент.mt < 5) 

После удаления ненужных ячеек из набора данных следующим шагом является нормализация данных. По умолчанию мы используем метод нормализации глобального масштабирования «LogNormalize», который нормализует измерения выражения признаков для каждой ячейки по общему выражению, умножает его на масштабный коэффициент (по умолчанию 10 000) и преобразует результат в журнал. Нормализованные значения хранятся в pbmc[["РНК"]]@данные .

 pbmc <- NormalizeData(pbmc, normalization. method = "LogNormalize", scale.factor = 10000) 

Для ясности в этой предыдущей строке кода (и в будущих командах) мы предоставляем значения по умолчанию для определенных параметров в вызов функции. Однако это не обязательно, и того же поведения можно добиться с помощью:

 pbmc <- NormalizeData(pbmc) 

Затем мы вычисляем подмножество признаков, которые демонстрируют высокую вариацию между ячейками в наборе данных (т. е. они высоко экспрессируются в одних клетках и низко экспрессируются в других). Мы и другие обнаружили, что сосредоточение внимания на этих генах в последующем анализе помогает выделить биологический сигнал в наборах данных по отдельным клеткам.

Наша процедура в Seurat подробно описана здесь и улучшена по сравнению с предыдущими версиями за счет прямого моделирования отношения среднего-дисперсии, присущего данным по одной ячейке, и реализована в функции FindVariableFeatures() . По умолчанию мы возвращаем 2000 объектов на набор данных. Они будут использоваться в последующем анализе, таком как PCA.

 pbmc <- FindVariableFeatures(pbmc, selection.method = "vst", nfeatures = 2000)
# Определить 10 наиболее изменчивых генов
top10 <- head(VariableFeatures(pbmc), 10)
# построить переменные объекты с метками и без них
plot1 <- VariableFeaturePlot (pbmc)
plot2 <- LabelPoints(plot = plot1, points = top10, repel = TRUE)
участок1 + участок2 

Затем мы применяем линейное преобразование («масштабирование»), которое является стандартным этапом предварительной обработки перед методами уменьшения размеров, такими как PCA. Функция ScaleData() :

• Изменяет экспрессию каждого гена так, чтобы среднее значение экспрессии по ячейкам равнялось 0
• Масштабирует экспрессию каждого гена так, чтобы дисперсия между ячейками равнялась 1
  • Этот шаг дает равный вес в последующем анализе, так что гены с высокой экспрессией не доминируют
• Результаты этого сохраняются в pbmc[["RNA"]]@scale. data

 all.genes <- имена строк (pbmc)
pbmc <- ScaleData(pbmc, features = all.genes) 

Этот шаг занимает слишком много времени! Могу ли я сделать это быстрее?

Масштабирование является важным шагом в рабочем процессе Seurat, но только для генов, которые будут использоваться в качестве входных данных для PCA. Таким образом, по умолчанию в ScaleData() выполняется масштабирование только ранее определенных переменных объектов (по умолчанию 2000). Для этого опустите имеет аргумент в предыдущем вызове функции, т.е.

 pbmc <- ScaleData(pbmc) 

Ваши результаты PCA и кластеризации не изменятся. Тем не менее, тепловые карты Seurat (созданные, как показано ниже, с помощью DoHeatmap() ) требуют масштабирования генов в тепловой карте, чтобы гены с высокой экспрессией не доминировали на тепловой карте. Чтобы потом не оставить ни одного гена на тепловой карте, в этом уроке мы масштабируем все гены.

Как удалить нежелательные источники вариаций, как в Seurat v2?

В Seurat v2 мы также используем функцию ScaleData() для удаления нежелательных источников вариаций из набора данных с одной ячейкой. Например, мы могли бы «регрессировать» гетерогенность, связанную, например, со стадией клеточного цикла или митохондриальным загрязнением. Эти функции все еще поддерживаются в ScaleData() в Seurat v3 , т.е.:

 pbmc <- ScaleData(pbmc, vars.to.regress = "percent.mt") 

Тем не менее, особенно для опытных пользователей, которые хотели бы использовать эту функцию, мы настоятельно рекомендуем использовать наш новый рабочий процесс нормализации, SCTransform() . Метод описан в нашей статье с отдельной виньеткой с использованием Seurat v3 здесь. Как и в случае с ScaleData() , функция SCTransform() также включает параметр vars. to.regress .

 

---

Затем мы выполняем PCA для масштабированных данных. По умолчанию в качестве входных данных используются только ранее определенные переменные функции, но их можно определить с помощью аргумента функций , если вы хотите выбрать другое подмножество.

 pbmc <- RunPCA(pbmc, features = VariableFeatures(object = pbmc)) 

Seurat предоставляет несколько полезных способов визуализации как ячеек, так и функций, определяющих PCA, включая VizDimReduction() , DimPlot() и DimHeatmap()

 # Изучите и визуализируйте результаты PCA несколькими способами.
print(pbmc[["pca"]], dims = 1:5, nfeatures = 5) 

 ## PC_ 1
## Положительный: CST3, TYROBP, LST1, AIF1, FTL
## Отрицательный: MALAT1, LTB, IL32, IL7R, CD2
## ПК_ 2
## Положительный: CD79А, MS4A1, TCL1A, HLA-DQA1, HLA-DQB1
## Отрицательный: NKG7, PRF1, CST7, GZMB, GZMA
## ПК_ 3
## Положительный: HLA-DQA1, CD79A, CD79B, HLA-DQB1, HLA-DPB1
## Отрицательный: PPBP, PF4, SDPR, SPARC, GNG11
## ПК_ 4
## Положительный: HLA-DQA1, CD79B, CD79A, MS4A1, HLA-DQB1
## Отрицательный: ВИМ, ИЛ7Р, С100А6, ИЛ32, С100А8
## ПК_ 5
## Положительный: GZMB, NKG7, S100A8, FGFBP2, GNLY
## Отрицательный: LTB, IL7R, CKB, VIM, MS4A7 

 VizDimLoadings(pbmc, dims = 1:2, уменьшение = "pca") 

 DimPlot(pbmc, уменьшение = "pca") 

В частности, DimHeatmap() позволяет легко исследовать первичные источники неоднородности в наборе данных и может быть полезно при попытке решить, какие компьютеры включить для дальнейшего последующего анализа. И ячейки, и функции упорядочены в соответствии с их оценками PCA. Установка 90 599 ячеек 90 600 на число отображает «крайние» ячейки на обоих концах спектра, что значительно ускоряет построение больших наборов данных. Хотя явно контролируемый анализ, мы считаем, что это ценный инструмент для изучения коррелированных наборов функций.

 DimHeatmap(pbmc, затемнения = 1, ячейки = 500, сбалансировано = TRUE) 

 DimHeatmap(pbmc, затемнения = 1:15, ячейки = 500, сбалансировано = TRUE) 

Чтобы преодолеть обширный технический шум в любом отдельном признаке для данных scRNA-seq Seurat группирует клетки на основе их оценок PCA, при этом каждый PC по существу представляет собой «метапризнак», который объединяет информацию по коррелированному набору признаков. Таким образом, главные основные компоненты представляют собой надежное сжатие набора данных. Однако, сколько компонентов мы должны включить? 10? 20? 100?

В Macosko и др. мы реализовали тест передискретизации, вдохновленный процедурой JackStraw. Мы случайным образом переставляем подмножество данных (по умолчанию 1%) и повторно запускаем PCA, создавая «нулевое распределение» оценок признаков, и повторяем эту процедуру. Мы идентифицируем «значительные» ПК как те, которые имеют сильное обогащение признаков с низким значением p.

 # ПРИМЕЧАНИЕ. Этот процесс может занять много времени для больших наборов данных, закомментируйте для удобства. Более
# приблизительные методы, такие как реализованные в ElbowPlot(), могут использоваться для уменьшения
# время вычисления
pbmc <- JackStraw (pbmc, num.replicate = 100)
pbmc <- ScoreJackStraw(pbmc, dims = 1:20) 

Функция JackStrawPlot() предоставляет средство визуализации для сравнения распределения p-значений для каждого ПК с равномерным распределением (пунктирная линия). «Значительные» ПК будут демонстрировать сильное обогащение признаков с низкими значениями p (сплошная кривая над пунктирной линией). В этом случае оказывается, что после первых 10-12 пк наблюдается резкое падение значимости.

 JackStrawPlot(pbmc, dims = 1:15) 

Альтернативный эвристический метод создает «график локтя»: ранжирование основных компонентов на основе процента дисперсии, объясненного каждым из них ( Функция ElbowPlot() ). В этом примере мы можем наблюдать «локоть» вокруг PC9-10, предполагая, что большая часть истинного сигнала захватывается в первых 10 PC.

 ElbowPlot(pbmc) 

Определение истинной размерности набора данных может быть сложным/неопределенным для пользователя. Поэтому мы предлагаем рассмотреть эти три подхода. Первый более контролируемый, он исследует ПК для определения соответствующих источников неоднородности и может использоваться, например, в сочетании с GSEA. Второй реализует статистический тест, основанный на случайной нулевой модели, но требует много времени для больших наборов данных и может не возвращать четкое отсечение ПК. Третий — это эвристика, которая обычно используется и может быть рассчитана мгновенно. В этом примере все три подхода дали одинаковые результаты, но мы, возможно, были бы правы, выбрав что-то между PC 7-12 в качестве порога.

Здесь мы выбрали 10, но рекомендуем пользователям учитывать следующее:

• Поклонники дендритных клеток и NK могут признать, что гены, тесно связанные с PC 12 и 13, определяют редкие иммунные подмножества (т. е. MZB1 является маркером плазмоцитоидных DC). Однако эти группы настолько редки, что их трудно отличить от фонового шума для набора данных такого размера без предварительной информации.
• Мы рекомендуем пользователям повторить последующие анализы с другим количеством ПК (10, 15 или даже 50!). Как вы увидите, результаты часто не сильно различаются.
• Мы советуем пользователям ошибаться при выборе этого параметра. Например, выполнение последующих анализов только с 5 ПК существенно и неблагоприятно влияет на результаты.

---

Seurat v3 применяет подход кластеризации на основе графов, основанный на исходных стратегиях, описанных в (Macosko и др. ). Важно отметить, что показатель расстояния , который управляет кластерным анализом (на основе ранее идентифицированных ПК), остается прежним. Однако наш подход к разбиению матрицы сотовых расстояний на кластеры значительно улучшился. Наш подход был в значительной степени вдохновлен недавними рукописями, в которых применялись подходы кластеризации на основе графов к данным scRNA-seq [SNN-Cliq, Xu and Su, Bioinformatics, 2015] и данным CyTOF [PhenoGraph, Levine и др. ., Cell, 2015]. Вкратце, эти методы встраивают ячейки в структуру графа — например, граф K ближайших соседей (KNN), с ребрами, проведенными между ячейками с похожими шаблонами выражения признаков, а затем пытаются разделить этот граф на сильно взаимосвязанные «квазиклики» или «сообщества».

Как и в PhenoGraph, сначала мы строим граф KNN на основе евклидова расстояния в пространстве PCA и уточняем веса ребер между любыми двумя ячейками на основе общего перекрытия в их локальных окрестностях (подобие Жаккара). Этот шаг выполняется с помощью FindNeighbors() и принимает в качестве входных данных ранее определенную размерность набора данных (первые 10 ПК).

Чтобы сгруппировать ячейки, мы затем применяем методы модульной оптимизации, такие как алгоритм Лувена (по умолчанию) или SLM [SLM, Blondel et al ., Journal of Statistical Mechanics], для итеративного группирования ячеек вместе с целью оптимизации стандартная функция модульности. Функция FindClusters() реализует эту процедуру и содержит параметр разрешения, который задает «зернистость» нисходящей кластеризации, причем увеличение значений приводит к большему количеству кластеров. Мы обнаружили, что установка этого параметра в диапазоне от 0,4 до 1,2 обычно дает хорошие результаты для наборов данных с одной ячейкой, содержащих около 3 тыс. ячеек. Оптимальное разрешение часто увеличивается для больших наборов данных. Кластеры можно найти с помощью Функция Idents() .

 pbmc <- FindNeighbors(pbmc, dims = 1:10)
pbmc <- FindClusters(pbmc, разрешение = 0,5) 

 ## Оптимизатор модульности, версия 1. 3.0, Людо Уолтман и Нис Ян ван Экк
##
## Количество узлов: 2638
## Количество ребер: 95927
##
## Запуск алгоритма Лувена...
## Максимальная модульность в 10 случайных запусках: 0,8728
## Количество сообществ: 9
## Прошедшее время: 0 секунд 

 # Просмотр идентификаторов кластера первых 5 ячеек
голова(иденты(pbmc), 5) 

 ## AAACATACAACCAC-1 AAACATTGAGCTAC-1 AAACATTGATCAGC-1 AAACCGTGCTTCCG-1
## 2 3 2 1
## AAACCGTGTATGCG-1
## 6
## Уровни: 0 1 2 3 4 5 6 7 8 

---

Seurat предлагает несколько методов нелинейного уменьшения размеров, таких как tSNE и UMAP, для визуализации и изучения этих наборов данных. Целью этих алгоритмов является изучение лежащего в основе многообразия данных, чтобы разместить похожие ячейки вместе в низкоразмерном пространстве. Ячейки внутри кластеров на основе графа, определенных выше, должны совместно локализоваться на этих графиках уменьшения размерности. В качестве входных данных для UMAP и tSNE мы предлагаем использовать те же ПК в качестве входных данных для кластерного анализа.

 # Если вы не установили UMAP, вы можете сделать это через reticulate::py_install(packages =
# 'umap-learn')
pbmc <- RunUMAP(pbmc, dims = 1:10) 

 # обратите внимание, что вы можете установить `label = TRUE` или использовать функцию LabelClusters, чтобы помочь пометить
# отдельные кластеры
DimPlot(pbmc, reduce = "umap") 

В этот момент вы можете сохранить объект, чтобы его можно было легко загрузить обратно без повторного выполнения шагов, требующих больших вычислительных ресурсов, выполненных выше, или легко поделиться с соавторами.

 saveRDS(pbmc, file = "../output/pbmc_tutorial.rds") 

---

Seurat может помочь вам найти маркеры, определяющие кластеры с помощью дифференциального выражения. По умолчанию он идентифицирует положительные и отрицательные маркеры одного кластера (указанного в ident.1 ) по сравнению со всеми другими ячейками. FindAllMarkers() автоматизирует этот процесс для всех кластеров, но вы также можете сравнивать группы кластеров друг с другом или со всеми ячейками.

Аргумент min.pct требует, чтобы признак обнаруживался с минимальным процентом в любой из двух групп ячеек, а аргумент thresh.test требует, чтобы признак был дифференциально выражен (в среднем) на некоторую величину между две группы. Вы можете установить для обоих этих параметров значение 0, но со значительным увеличением времени, поскольку при этом будет проверяться большое количество функций, которые вряд ли будут сильно дискриминационными. В качестве еще одного варианта ускорения этих вычислений 9Можно установить 0599 max.cells.per.ident . Это уменьшит выборку каждого класса удостоверений, чтобы иметь не больше ячеек, чем то, на что это установлено. В то время как обычно происходит потеря мощности, увеличение скорости может быть значительным, и наиболее сильно выраженные особенности, вероятно, все равно будут подниматься на вершину.

 # найти все маркеры кластера 2
cluster2.markers <- FindMarkers (pbmc, ident.1 = 2, min.pct = 0,25)
head(cluster2. markers, n = 5) 

 ## p_val avg_log2FC pct.1 pct.2 p_val_adj
## Ил32 2,892340e-90 1.2013522 0.947 0.465 3.966555e-86
## LTB 1.060121e-86 1.2695776 0.981 0.643 1.453850e-82
## CD3D 8.794641e-71 0.9389621 0.922 0.432 1.206097e-66
## Ил7Р 3,516098э-68 1,1873213 0,750 0,326 4,821977э-64
## LDHB 1.642480e-67 0.8969774 0.954 0.614 2.252497e-63 

 # найти все маркеры, отличающие кластер 5 от кластеров 0 и 3
cluster5.markers <- FindMarkers (pbmc, ident.1 = 5, ident.2 = c(0, 3), min.pct = 0,25)
head(cluster5.markers, n = 5) 

 ## p_val avg_log2FC pct.1 pct.2 p_val_adj
## FCGR3A 8.246578e-205 4.261495 0,975 0,040 1,130936э-200
## IFITM3 1.677613e-195 3.879339 0.975 0.049 2.300678e-191
## CFD 2.401156e-193 3.405492 0.938 0.038 3.292945e-189
## CD68 2.4e-191 3.020484 0.926 0.035 3.977587e-187
## RP11-290F20.3 2.513244e-186 2.720057 0.840 0.017 3.446663e-182 

 # найти маркеры для каждого кластера по сравнению со всеми оставшимися ячейками, сообщать только о положительных
# единицы
pbmc. markers <- FindAllMarkers (pbmc, only.pos = TRUE, min.pct = 0,25, logfc.threshold = 0,25)
pbmc.markers %>%
    group_by(кластер) %>%
    slice_max(n = 2, order_by = avg_log2FC) 

 ## # Тиббл: 18 × 7
## # Группы: кластер [9]
## p_val avg_log2FC pct.1 pct.2 p_val_adj ген кластера
##       
## 1 9.57e- 88 1.36 0.447 0.108 1.31e- 83 0 CCR7
## 2 3.75e-112 1.09 0.912 0.592 5.14e-108 0 LDHB
## 3 0 5,57 0,996 0,215 0 1 S100A9
## 4 0 5,48 0,975 0,121 0 1 S100A8
## 5 1.06e- 86 1.27 0.981 0,643 1,45е- 82 2 лтб
## 6 2.97e- 58 1.23 0.42 0.111 4.07e- 54 2 AQP3
## 7 0 4,31 0,936 0,041 0 3 CD79A
## 8 9.48e-271 3.59 0.622 0.022 1.30e-266 3 TCL1A
## 9 5.61e-202 3.10 0.983 0.234 7.70e-198 4 CCL5
## 10 7.25э-165 3.00 0.577 0.055 9.95э-161 4 ГЗМК
## 11 3.51e-184 3.31 0.975 0.134 4.82e-180 5 FCGR3A
## 12 2.03e-125 3.09 1 0.315 2.78e-121 5 LST1
## 13 3.13e-191 5,32 0,961 0,131 4,30е-187 6 ГНЛЛ
## 14 7.95e-269 4.83 0.961 0.068 1.09e-264 6 ГЗМБ
## 15 1.48e-220 3.87 0. 812 0.011 2.03e-216 7 FCER1A
## 16 1.67e- 21 2.87 1 0.513 2.28e- 17 7 HLA-DPB1
## 17 1.92e-102 8.59 1 0.024 2.63e- 98 8 ППБФ
## 18 9.25e-186 7.29 1 0.011 1.27e-181 8 PF4 

В Seurat есть несколько тестов дифференциального выражения, которые можно задать с помощью параметра test.use (подробности см. в виньетке DE). Например, тест ROC возвращает «мощность классификации» для любого отдельного маркера (от 0 — случайный до 1 — идеальный).

 cluster0.markers <- FindMarkers(pbmc, ident.1 = 0, logfc.threshold = 0,25, test.use = "roc", only.pos = TRUE) 

Мы включили несколько инструментов для визуализации выражения маркера. VlnPlot() (показывает распределение вероятностей выражений по кластерам) и FeaturePlot() (визуализирует выражение признаков на графике tSNE или PCA) являются нашими наиболее часто используемыми визуализациями. Мы также предлагаем изучить RidgePlot() , CellScatter() и DotPlot() в качестве дополнительных методов для просмотра набора данных.

 VlnPlot(pbmc, features = c("MS4A1", "CD79A")) 

 # вы также можете отображать необработанные подсчеты
VlnPlot(pbmc, features = c("NKG7", "PF4"), slot = "counts", log = TRUE) 

 FeaturePlot(pbmc, features = c("MS4A1", "GNLY", "CD3E" , "CD14", "FCER1A", "FCGR3A", "LYZ", "PPBP",
    "CD8A")) 

DoHeatmap() генерирует тепловую карту выражений для заданных ячеек и признаков. В этом случае мы наносим 20 лучших маркеров (или все маркеры, если их меньше 20) для каждого кластера.

 pbmc.markers %>%
    group_by(кластер) %>%
    top_n(n = 10, вес = avg_log2FC) -> топ10
DoHeatmap(pbmc, features = top10$gene) + NoLegend() 

Что такое растровые данные?—Справка | ArcGIS for Desktop

• Зачем хранить данные в виде растра?
• Общие характеристики растровых данных

В своей простейшей форме растр состоит из матрицы ячеек (или пикселей), организованных в строки и столбцы (или сетку), где каждая ячейка содержит значение, представляющее информацию, например температуру. Растры — это цифровые аэрофотоснимки, изображения со спутников, цифровые изображения или даже отсканированные карты.

Данные, хранящиеся в растровом формате, представляют явления реального мира:

• Тематические данные (также называемые дискретными) представляют такие объекты, как данные о землепользовании или почвах.
• Непрерывные данные представляют такие явления, как температура, высота или спектральные данные, такие как спутниковые изображения и аэрофотоснимки.
• Изображения включают отсканированные карты или чертежи и фотографии зданий.

Тематические и непрерывные растры могут отображаться как слои данных вместе с другими географическими данными на вашей карте, но часто используются в качестве исходных данных для пространственного анализа с помощью дополнительного модуля ArcGIS Spatial Analyst. Растры изображений часто используются в качестве атрибутов в таблицах — они могут отображаться вместе с вашими географическими данными и использоваться для передачи дополнительной информации об объектах карты.

Узнайте больше о тематических и непрерывных данных

Хотя структура растровых данных проста, они исключительно полезны для широкого круга приложений. В ГИС растровые данные используются в четырех основных категориях:

• Растры в качестве базовых карт

  Обычно растровые данные в ГИС используются в качестве фонового изображения для других векторных слоев. Например, ортофотографии, отображаемые под другими слоями, дают пользователю карты уверенность в том, что слои карты выровнены в пространстве и представляют реальные объекты, а также дополнительную информацию. Тремя основными источниками растровых базовых карт являются ортофотоснимки с аэрофотоснимков, спутниковые снимки и отсканированные карты. Ниже показан растр, используемый в качестве базовой карты для дорожных данных.

• Растры в качестве карт поверхности

  Растры хорошо подходят для представления данных, которые постоянно меняются по ландшафту (поверхности). Они обеспечивают эффективный метод сохранения непрерывности в виде поверхности. Они также обеспечивают регулярное представление поверхностей. Значения высоты, измеренные от поверхности земли, являются наиболее распространенным применением карт поверхности, но другие значения, такие как осадки, температура, концентрация и плотность населения, также могут определять поверхности, которые можно анализировать в пространстве. В растре ниже отображается высота: зеленым цветом показаны более низкие отметки, а красными, розовыми и белыми ячейками — более высокие отметки.

• Растры как тематические карты

  Растры, представляющие тематические данные, могут быть получены путем анализа других данных. Распространенным приложением для анализа является классификация спутникового изображения по категориям земного покрова. По сути, это действие группирует значения мультиспектральных данных в классы (например, тип растительности) и присваивает категориальное значение. Тематические карты также могут быть получены в результате операций геообработки, объединяющих данные из различных источников, таких как векторные, растровые данные и данные рельефа. Например, вы можете обрабатывать данные с помощью модели геообработки, чтобы создать набор растровых данных, отображающий пригодность для конкретной деятельности. Ниже приведен пример классифицированного набора растровых данных, показывающий землепользование.

• Растры как атрибуты объекта

  Растры, используемые в качестве атрибутов объекта, могут быть цифровыми фотографиями, отсканированными документами или отсканированными рисунками, относящимися к географическому объекту или местоположению. Слой участков может иметь отсканированные юридические документы, идентифицирующие последнюю транзакцию для этого участка, или слой, представляющий входы в пещеры, может иметь изображения реальных отверстий в пещерах, связанных с точечными объектами. Ниже приведено цифровое изображение большого старого дерева, которое можно использовать в качестве атрибута ландшафтного слоя, который может поддерживаться городом.

Зачем хранить данные в виде растра?

Иногда у вас нет возможности хранить данные в виде растра; например, изображения доступны только в виде растра. Однако существует множество других пространственных объектов (таких как точки) и измерений (таких как осадки), которые могут храниться как растровые или векторные данные.

Хранение данных в виде растра имеет следующие преимущества:

• Простая структура данных — матрица ячеек со значениями, представляющими координаты и иногда связанные с таблицей атрибутов
• Мощный формат для расширенного пространственного и статистического анализа
• Возможность представления непрерывных поверхностей и выполнения анализа поверхностей
• Возможность унифицированного хранения точек, линий, полигонов и поверхностей
• Возможность быстрого наложения сложных наборов данных

Существуют и другие соображения по поводу хранения данных в виде растра, которые могут убедить вас в использовании варианта хранения на основе векторов. Например:

Узнайте больше о представлении объектов в наборе растровых данных

Общие характеристики растровых данных

В наборах растровых данных каждая ячейка (которая также называется пикселем) имеет значение. Значения ячеек представляют явления, отображаемые набором растровых данных, такие как категория, величина, высота или спектральное значение. Категорией может быть класс землепользования, такой как пастбища, леса или дороги. Величина может представлять гравитацию, шумовое загрязнение или процент осадков. Высота (расстояние) может представлять собой возвышение поверхности над средним уровнем моря, которое можно использовать для получения свойств уклона, экспозиций и водосборных бассейнов. Спектральные значения используются в спутниковых снимках и аэрофотосъемке для представления коэффициента отражения света и цвета.

Значения ячеек могут быть как положительными, так и отрицательными, целыми или с плавающей запятой. Целочисленные значения лучше всего использовать для представления категориальных (дискретных) данных, а значения с плавающей запятой — для представления непрерывных поверхностей. Дополнительные сведения о дискретных и непрерывных данных см. в разделе Дискретные и непрерывные данные. Ячейки также могут иметь значение NoData, обозначающее отсутствие данных. Для получения информации о NoData см. NoData в наборах растровых данных.

Растры хранятся в виде упорядоченного списка значений ячеек, например, 80, 74, 62, 45, 45, 34 и т. д.

Область (или поверхность), представляемая каждой ячейкой, имеет одинаковую ширину и высоту и является равной частью всей поверхности, представляемой растром. Например, растр, представляющий рельеф (то есть цифровая модель рельефа), может охватывать площадь в 100 квадратных километров. Если бы в этом растре было 100 ячеек, каждая ячейка представляла бы 1 квадратный километр одинаковой ширины и высоты (то есть 1 км x 1 км).

Размер ячеек может быть настолько большим или маленьким, насколько это необходимо для представления поверхности, передаваемой набором растровых данных, и объектов на поверхности, таких как квадратный километр, квадратный фут или даже квадратный сантиметр. Размер ячейки определяет, насколько грубыми или мелкими будут отображаться узоры или объекты в растре. Чем меньше размер ячейки, тем ровнее или детальнее будет растр. Однако чем больше количество ячеек, тем больше времени потребуется на их обработку, и это увеличит потребность в пространстве для хранения. Если размер ячейки слишком велик, информация может быть потеряна или тонкие закономерности могут быть скрыты. Например, если размер ячейки больше ширины дороги, дорога может отсутствовать в наборе растровых данных. На диаграмме ниже вы можете увидеть, как этот простой полигональный объект будет представлен набором растровых данных с различными размерами ячеек.

Местоположение каждой ячейки определяется строкой или столбцом, в котором она расположена в растровой матрице. По сути, матрица представлена ​​декартовой системой координат, в которой строки матрицы параллельны оси x, а столбцы — оси y декартовой плоскости. Значения строки и столбца начинаются с 0. В приведенном ниже примере, если растр находится в системе координат универсальной поперечной проекции Меркатора (UTM) и имеет размер ячейки 100, местоположение ячейки 5,1 будет равно 300 500 восток, 5,0 северной широты.

Узнайте о преобразовании набора растровых данных

Часто вам нужно указать экстент растра. Экстент определяется верхней, нижней, левой и правой координатами прямоугольной области, покрываемой растром, как показано ниже.

Похожие темы

Паттерн инфильтрации иммунными клетками в моделях немелкоклеточного рака легкого PDX является имманентным признаком модели и коррелирует с отчетливым молекулярным и фенотипическим строением

Текст статьи

Меню статьи

• Статья
  Текст
• Артикул
  информация
• Цитата
  Инструменты
• Поделиться
• Быстрое реагирование
• Артикул
  метрика
• Оповещения

PDF

Базовая иммунология опухолей

Оригинальное исследование

Паттерн инфильтрации иммунных клеток в моделях немелкоклеточного рака легкого PDX является имманентным признаком модели и коррелирует с отчетливым молекулярным и фенотипическим строением

1. Eva Oswald1,
2. Daniel Bug2,
3. Anne Grote3,
4. Kanstantsin Lashuk1,
5. Nassim Bouteldja2,
6. Dorothee Lenhard1,
7. Anne Löhr1,
8. Anke Behnke1,
9. Volker Knauff1,
10. Анна Эдингер1,
11. Керстин Клингнер1,
12. Симона Гедике4,
13. Габриэле Нидерманн4,5,
14. Дорит Мерхоф2,
15. http://orcid. org/0000-0002-1234-982XFriedrich Feuerhake3 and
16. http://orcid.org/0000-0003-1984-7343Julia Schueler1

1. ¹ Charles River Discovery Research Services Gemany GmbH, Charles River Laboratories Inc, Freiburg, Germany
2. ² Институт визуализации и компьютерного зрения, Рейнско-Вестфальский технический университет Ахена, Ахен, Германия
3. ³ Кафедра патологии Ганноверской медицинской школы, Ганновер, Германия
4. ⁴ Кафедра радиационной онкологии, Медицинский центр Фрайбургского университета, Фрайбург, Германия
5. ⁵ Немецкий онкологический консорциум, Гейдельберг, Германия

1. Корреспонденция д-ру Джулии Шуэль; julia.schueler{at}crl.com

Abstract

Background Область иммунологии рака быстро движется к инновационным терапевтическим стратегиям, что приводит к необходимости надежных и прогностических доклинических платформ, отражающих иммунологический ответ на рак. Хорошо охарактеризованные доклинические модели необходимы для разработки прогностических биомаркеров в онкологии, а также в области иммуноонкологии. В текущем исследовании доклинические модели золотого стандарта совершенствуются и объединяются с новыми инструментами анализа изображений для удовлетворения этих требований.

Методы Панель из 14 моделей ксенотрансплантатов, полученных от пациентов с немелкоклеточным раком легкого (NSCLC PDX), размножали на гуманизированных мышах NOD/Shi-scid/IL-2Rnull. Модели были всесторонне охарактеризованы в отношении соответствующих фенотипических и молекулярных признаков, включая проточную цитометрию, иммуногистохимию, гистологию, секвенирование полного экзома и секрецию цитокинов.

Результаты Модели, отражающие горячие (> 5% инфильтрирующих опухоль лимфоцитов/TIL) в отличие от холодных опухолей (<5% TIL), значительно различались в отношении профилей цитокинов, молекулярно-генетических аберраций, содержания стромы и лиганда запрограммированной гибели клеток. 1 статус. Эксперименты по лечению, включающие анти-цитотоксический белок 4, ассоциированный с Т-лимфоцитами, анти-программируемую гибель клеток 1 или их комбинацию во всех 14 моделях в формате испытания на одной мыши, показали отчетливую реакцию роста опухоли и пространственные паттерны иммунных клеток, которые отслеживались с помощью компьютерного анализа оцифрованных изображения целиком. Анализ изображений впервые дал качественную оценку степени, в которой модели PDX сохраняют гистологические особенности своих исходных доноров-людей.

Выводы Глубокое фенотипирование моделей PDX в гуманизированных условиях с помощью комбинаций компьютерной патологии, иммуногистохимии, проточной цитометрии и протеомики позволяет проводить исчерпывающий анализ инновационных доклинических моделей и прокладывает путь к разработке трансляционных биомаркеров для иммуноонкологических препаратов.

• новообразования легких
• микроокружение опухоли
• биомаркеры, опухоль
• иммуногистохимия

Заявление о доступности данных

Полное секвенирование экзома, секвенирование РНК и отсканированные изображения доступны в общедоступном хранилище с открытым доступом. Запрос алгоритма анализа изображения предоставляется по обоснованному запросу. Все данные, непосредственно относящиеся к исследованию, включены в статью или загружены в качестве дополнительной информации. Данные RNASeq и целого экзома Seq доступны через https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra, данные изображений модели PDX доступны через IDR (https://idr.openmicrooscopy.org/tissue/). Все дополнительные данные, относящиеся к исследованию, либо загружаются в качестве дополнительной информации, либо могут быть запрошены у старших авторов JS (модели животных), FF (цифровая и обычная патология) или DM (цифровая патология/анализ изображений).

http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

Эта статья находится в открытом доступе и распространяется в соответствии с некоммерческой лицензией Creative Commons Attribution (CC BY-NC 4.0), которая разрешает другим распространять , ремикшировать, адаптировать, использовать эту работу в некоммерческих целях и лицензировать свои производные работы на других условиях, при условии, что оригинальная работа правильно процитирована, указаны соответствующие авторские права, указаны любые внесенные изменения, а использование является некоммерческим. См. http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/.

http://dx.doi.org/10.1136/jitc-2021-004412

Статистика с сайта Altmetric.com

Запрос разрешений

направит вас к службе RightsLink Центра защиты авторских прав. Вы сможете получить быструю цену и мгновенное разрешение на повторное использование контента различными способами.

• новообразования легких
• микроокружение опухоли
• биомаркеры опухоли
• иммуногистохимия

Ключевые сообщения

Что уже известно по этой теме

Что добавляет это исследование

Как это исследование может повлиять на исследования, практику и/или политику мелкоклеточный рак легкого (НМРЛ), и потребность в прогностических биомаркерах резко возросла с появлением иммунотерапии. Биомаркеры для соединений, нацеленных на определенные генетические аберрации, значительно отличаются от биомаркеров для иммуномодулирующих препаратов, поскольку последние являются непрерывными, зависят от времени и контекста и требуют учета множества факторов.

Исследования рака в значительной степени опираются на модели животных, часто основанные на опухолевых клетках человека, трансплантированных мышам с ослабленным иммунитетом. международных инициатив, направленных на систематическую характеристику PDX, охватывающих широту и глубину различных типов рака, прогностическая ценность этой модельной платформы значительно возросла.7 Доступность больших, хорошо охарактеризованных коллекций PDX позволила использовать форматы скрининга in vivo. которые позволяют исследовать многочисленные соединения в опухолевой панели, отражающей гетерогенность пациентов: формат исследования на одной мыши (SMT) определяется размером группы n = 1 на группу лечения и модель. Эта исследовательская парадигма поддерживает идентификацию чувствительных субпопуляций, что позволяет открывать прогностические биомаркеры, крайне необходимые в области иммуноонкологии. 8

Тем не менее, модели PDX могут лишь частично отражать опухоль in situ, поскольку опухолевые клетки человека взаимодействуют с микроокружением мыши. Этот пробел, вероятно, способствует высокому показателю отсева противораковых препаратов на ранних стадиях клинической разработки, часто не достигая их первичных конечных точек, в то время как доклинические данные обнадеживают.9–11

В 2002 г. мыши и их родственники стали доступны научному сообществу.12 Эти новые линии мышей, обладающие беспрецедентной степенью подавления иммунитета, позволили разработать так называемых гуманизированных мышей. Хотя рекапитуляция иммунной системы человека все еще не завершена, их способность предсказывать противоопухолевую активность иммуномодулирующих соединений была доказана, по крайней мере, для Т-клеточной терапии.13-16

В этом исследовании мы стремились объединить три общепризнанных доклинических актива: PDX, формат SMT и гуманизированный NSG (huNSG) для разработки доклинической исследовательской платформы, расширяющей скрининг инновационных кандидатов в иммуноонкологические препараты с помощью инструментов для сопутствующей разработки биомаркеры, которые поддерживают стратификацию в ранних клинических испытаниях.

Материалы и методы

Характеристика PDX у гуманизированных мышей

NSCLC Модели PDX имплантировали подкожно самкам NSG или huNSG в возрасте 4–6 недель (Charles River, Франция) под анестезией изофлураном. Рост опухоли определяли двумерным измерением штангенциркулем два раза в неделю. Анализы моделей PDX проводили, когда размер опухоли достигал 400–500 мм³: образцы опухолей отбирали для последующего анализа с помощью проточной цитометрии, гистологии и определения цитокинов. Кроветворные органы, такие как периферическая кровь (ПБ), костный мозг (КМ) и селезенка, анализировались с помощью проточной цитометрии.

Пациент с образцами НМРЛ

Была обработана серия, включающая 52 фиксированных формалином залитых парафином (FFPE) образцов полностью анонимных архивных избыточных материалов (Институт патологии, Ганноверская медицинская школа), представляющих полный спектр общих гистологических вариаций в диагностической оценке НМРЛ. иммуногистохимически, как описано ниже, для сравнения с образцами, полученными из PDX.

Эксперименты по лечению in vivo

Имплантацию проводили, как описано выше. Животных с опухолями объемом 80–100 мм³ распределяли на экспериментальные группы по принципу испытания на одной мыши.8 День рандомизации и начала лечения обозначали как 0-й день. Оба соединения и их комбинацию вводили внутрибрюшинно. Подробности приведены в дополнительной онлайн-таблице 1. Объем опухоли и массу тела определяли два раза в неделю.

Оценка противоопухолевой активности

Относительный объем отдельной опухоли в день X рассчитывали путем деления абсолютного объема мм3 соответствующей опухоли в день X на абсолютный объем той же опухоли в день рандомизации (= день 0 ). Ингибирование опухоли в конкретный день (испытание/контроль (Т/К)) рассчитывали по относительному объему испытуемой группы и относительному объему контрольной группы.

Иммуногистохимия PD-L1 человека и CD45 человека

После извлечения антигена срезы ткани FFPE толщиной 5 мкМ инкубировали с антителом против лиганда 1 программируемой гибели клеток человека (PD-L1) (1:200, кат. № 13,684S, Cell Signaling, США) или антителом против CD45 человека ( 1:300, кат. № AB40763, Abcam, Великобритания) в течение 60 мин при 37°C с последующим окрашиванием 3,3'-диаминобензидином (DAB) и контрастным окрашиванием гематоксилином. Слайды сканировали с разрешением 0,253 мкм/пиксель (40×) с помощью сканера Aperio AT2 (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany).

Анализ изображений

Оцифрованные изображения иммуногистохимических (ИГХ) слайдов оценивали для определения процента PD-L1-позитивных областей с использованием программного обеспечения OSANO. Экспрессия CD45 с использованием методов цветовой классификации и морфологической обработки изображений. Классификацию тканей проводили, как описано выше, на оцифрованных изображениях предметных стекол H&E.от 1156 5 до 1×10 ⁶ ) от животных, несущих опухоль, собирали и инкубировали с первичным антителом или изотипическим контролем, а среднюю интенсивность флуоресценции анализировали с помощью проточной цитометрии (FC). Окрашивание проводили в присутствии антител к CD16/CD32, чтобы блокировать неспецифическое окрашивание. Информация об антителах указана в дополнительной онлайн-таблице 2. Образцы анализировали на акустическом фокусирующем цитометре Attune NXT (Applied Biosystems), который зарегистрировал 50 000 событий.

Анализ биоплекса на основе гранул

Опухолевая ткань была проанализирована в соответствии с инструкциями производителя. Для обнаружения цитокинов человека использовали панель Bio-Plex Pro Human Chemokine Panel (# 171AK99MR2, Bio-Rad, США), а для обнаружения цитокинов мыши — анализ Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex (# M60009RDPD, Bio-Rad). был использован. Все анализы были выполнены на системе Bio-Plex 200 (№ 171000201, Bio-Rad)

Статистический анализ

Для расчета сообщаемого значения р ценности. Для сравнения данных ФК статистическую значимость определяли по методу Холма-Сидака с альфа=0,05. Для сравнения данных цитокинов применяли парный t-критерий отношения. Каждая строка анализировалась отдельно, без предположения о постоянном стандартном отклонении. Схема на рисунке для описания значения p была следующей: ****p<0,0001, ***p=0,0001 до 0,001; **р=0 от 0,001 до 0,01; *р=0,01 до 0,05; нс: р≥0,05. Описательный анализ проводился всякий раз, когда это уместно, с использованием программного обеспечения GraphPrism (www.graphpad.com).

Оценка EMT

Оценка эпителиально-мезенхимального перехода (EMT) была построена на наборе генов, опубликованном Taube et al. Е-кадгерин. Основываясь на уровнях экспрессии РНК соответствующих генов, 14 моделей NSCLC PDX получили конкретную оценку EMT, которая была рассчитана в соответствии с Rudisch et al. 20 путем масштабирования значений экспрессии по генам и последующего получения среднего значения генов в EMT. подпись.21

Производство трехмерных стопок

Образцы FFPE были нарезаны на предметные стекла толщиной 3 мкм. Последовательно вырезали пять предметных стекол, оставляя интервал 80 мкм, затем вырезали следующие пять предметных стекол. Это повторялось на протяжении всего квартала. Первый слайд каждого среза окрашивали H&E, а второй слайд окрашивали на huCD45 в соответствии с протоколом, описанным выше.

Результаты

Модели NSCLC PDX сохраняют гистологические особенности опухоли пациента-донора

Панель моделей NSCLC PDX была основана на 14 первичных опухолях, охватывающих наиболее распространенные подтипы. Основные характеристики PDX и основная информация о пациенте-доноре перечислены в дополнительных онлайн-таблицах 3 и 4. Модели PDX сохраняли свой типичный гистопатологический вид во время серийного пассирования (n = 4) у мышей с ослабленным иммунитетом, визуально демонстрируя идентичные характеристики (рис. 1A). ). Мы подтвердили это наблюдение с помощью количественной оценки объективного класса тканей на репрезентативных сканах цельных слайдов H&E от пациентов-доноров и соответствующих PDX. Пропорции основных классов тканей опухоли, стромы и некроза сохраняются во время создания модели и оказались постоянными в отдельных моделях опухолей (рис. 1В).

Рисунок 1

(A) Гистологические особенности выбранного немелкоклеточного рака легкого PDX и соответствующей ткани пациента. Окрашивание гематоксилин-эозином готовили из фиксированных формалином залитых в парафин образцов ткани пациента-донора, а также из четвертого пассажа мышей NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ полученного из них PDX. Целые слайды были отсканированы, и из сканов были извлечены файлы JPEG с 10-кратным увеличением (включая масштабную линейку). (B) Алгоритм классификации тканей использовался для оценки процента классов тканей в пределах одного отсканированного предметного стекла, окрашенного гематоксилин-эозином. Для каждого пациента-донора (pt) и для каждого PDX анализировали одно окрашенное H&E изображение цельного предметного стекла. Результаты представлены в процентах от анализируемой площади. СА карцинома; LXFA, ксенотрансплантат рака легкого Фрайбург, аденокарцинома; LXFE, ксенотрансплантат рака легкого Фрайбург, эпителиальный; LXFL, ксенотрансплантат рака легкого Фрайбург, крупноклеточный; PDX, ксенотрансплантат, полученный от пациента.

Паттерн инфильтрации иммунными клетками является неотъемлемой чертой модели и может быть использован для классификации PDX-моделей НМРЛ на горячие и холодные опухоли

Мы оценили влияние имплантации опухоли на приживление иммунных клеток человека и наоборот Влияние иммунных клеток человека на рост опухоли. Анализы FC PB, BM и селезенки мышей с опухолью по сравнению с мышами без опухоли не выявили существенных различий между обеими группами (онлайн-дополнительная фигура 1A). И наоборот, присутствие иммунных клеток человека не изменяет рост, характерный для моделей NSCLC PDX. Это в качестве примера показано на дополнительном онлайн-рисунке 1B, где ксенотрансплантат рака легкого Фрайбурга, аденокарцинома (LXFA) 983 средний объем опухоли с течением времени представлен в NSG, Военно-морском медицинском исследовательском институте (NMRI) nu/nu и huNSG.

14 моделей PDX были имплантированы подкожно в huNSG (одна опухоль на модель на мышь), и иммунные клетки человека в опухоли, BM, селезенке и PB были количественно определены с помощью FC (рисунок 2A, онлайн-дополнительный рисунок 2A). Применяя порог 5% инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TIL), мы определили две группы, горячие и холодные опухоли, которые показывают очень значительную разницу в процентном соотношении TIL (p<0,00012). Сравнивая инфильтрацию иммунных клеток в различных системах органов между этими двумя группами, только фракция CD4 + в селезенке показала значительные различия (p<0,04). Соотношение CD4+/CD8+ в опухолевой ткани, как правило, было выше у мышей с холодовыми опухолями (незначительно (н.с.)). Примечательно, что в костном мозге и селезенке соотношение CD4+/CD8+ было значительно ниже при холодовых опухолях (онлайн-дополнительная фигура 2B, p<0,04). Следует отметить, что приживление иммунных клеток человека в PB до имплантации опухоли было сходным у отдельных мышей huNSG, получавших холодные или горячие опухоли (онлайн-дополнительная фигура 2C). Анализ FC одного образца на модель был репрезентативным для модели как таковой, как показано в независимых экспериментах для LXFA 9.83, LXFA 1674 и ксенотрансплантат рака легкого Freiburg, крупноклеточный (LXFL) 526 (онлайн-дополнительная фигура 2D).

Рисунок 2

(A) Анализ проточной цитометрией иммунных клеток человека в опухоли гуманизированных мышей NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ, когда объем опухоли достиг 400–500 мм³. Всего было проанализировано 14 животных с 14 различными моделями. Отдельные точки данных отображаются в виде диаграмм с минимумом и максимумом в виде усов, а медиана отображается в виде линии в рамке. Процент CD45+клеток в опухолевой ткани использовали в качестве критерия классификации на холодные (<5%) и горячие (>5%) опухоли соответственно. По этому критерию семь моделей были отнесены к группе холодных опухолей, а остальные семь – к группе горячих опухолей. (B) Уровни 38 человеческих и 23 мышиных цитокинов в опухолевой ткани горячих и холодных опухолей определяли для всех 14 моделей. Абсолютное значение пг белка/мг ткани нанесено на модель цитокина и опухоли. Жирным шрифтом выделены цитокины с более чем двукратным средним значением экспрессии в горячих опухолях по сравнению с холодными, подчеркнуты цитокины с более чем двукратным средним значением экспрессии в холодных опухолях по сравнению с горячими опухолями. Звездочки указывают статистическую разницу между группой холодных и горячих опухолей для определенного цитокина (критерий Манна-Уитни). (C) Влияние присутствия иммунных клеток человека в мышином хозяине определяли путем расчета кратности изменения 38 человеческих и 23 мышиных цитокинов в гуманизированных условиях по сравнению с негуманизированными для каждой модели и отображали в виде тепловой карты. Звездочки указывают статистическую разницу между группой негуманизированных и гуманизированных опухолей для определенного цитокина (критерий Манна-Уитни). G-CSF, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор; ГМ-КСФ, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор; ИФН, интерферон; ИЛ, интерлейкин; LXFA, ксенотрансплантат рака легкого Фрайбург, аденокарцинома; LXFE, ксенотрансплантат рака легкого Фрайбург, эпителиальный; LXFL, ксенотрансплантат рака легкого Фрайбург, крупноклеточный; TNF, фактор некроза опухоли.

Горячие и холодные опухоли демонстрируют специфический набор цитокинов человека

Горячие и холодные опухоли демонстрируют разные цитокиновые профили. Экспрессия четырех цитокинов человека более чем в два раза выше в холодных опухолях, тогда как экспрессия 17 цитокинов человека более чем в два раза выше в горячих опухолях, девять из них показывают статистически значимое различие. Только три мышиных цитокина активировались более чем в два раза в горячих опухолях и ни одного в холодных опухолях (все н.с., рис. 2В). Среди цитокинов человека с повышенной экспрессией в горячих опухолях были интерлейкин (IL)-16 и CXCL-13, которые, как известно, являются хемотаксическими для активированных Т-клеток. Кроме того, нейтрофилы, привлекающие цитокины CX3CL-1 и CXCL-6, были усилены наряду с провоспалительными цитокинами интерлейкином (IL)-2, IL-6 и гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (GM-CSF) (онлайн-дополнительная фигура 3) . Повышенные средние уровни экспрессии в холодовых опухолях сопровождались широким распространением, и поэтому их биологические последствия еще предстоит выяснить. Три мышиных цитокина с повышенной экспрессией IL-1a, Eotaxin и MIP-1a действительно оказывают провоспалительное действие, указывая на то, что мышиная часть микроокружения опухоли участвует в рекрутировании иммунных клеток человека (онлайн-дополнительная фигура 3). Влияние присутствия иммунных клеток человека в организме мыши-хозяина определяли путем расчета кратности изменения между негуманизированными и гуманизированными условиями на модель (рис. 2C) для человека, а также панель цитокинов мыши. Несколько мышиных цитокинов экспрессировались исключительно в присутствии иммунных клеток человека: Mo IL-2, Mo IL-5, Mo IL-10, Mo IL-17, Mo G-CSF, Mo GM-CSF. Кроме того, в большинстве моделей опухолей сильно активировалась другая группа мышиных цитокинов: Mo IL-6, Mo IL-9., Mo-IL-12, Mo IL-13, Mo интерферон (IFN)-γ, Mo цитокин, полученный из кератиноцитов (KC), Mo хемокин хематтракта моноцитов (MCP-1). Большинство этих цитокинов обладают провоспалительным эффектом. В явном виде описано, что IL-17 усиливает пролиферацию фибробластов и секрецию ими провоспалительных цитокинов. Тем не менее повышенная секреция IL-10 и IL-13 указывает на контррегуляцию гомеостаза иммунных клеток. В соответствии с этим наблюдалось подавление Mo IL-1a и b, Mo IL-3, Mo IL-4 и фактора некроза опухоли Mo (TNF)-α. Эффективность этого механизма регуляции можно увидеть, среди прочего, в сходных характеристиках роста отдельных моделей опухолей в отсутствие иммунных клеток человека на примере LXFA 9.83 (онлайн-дополнительный рисунок 1B). Экспрессия 24 из 38 цитокинов человека специфически или статистически значимо выше в присутствии иммунных клеток человека. Примечательно, что провоспалительные и частично противоопухолевые белки, такие как CXCL-13, IFN-γ, CCL8 и CXCL9, сильно активируются в присутствии иммунных клеток человека. Не наблюдалось различий между горячими и холодными опухолями в отношении регуляции цитокинов у мышей в зависимости от присутствия иммунных клеток человека.

Горячие и холодные опухоли характеризуются различными молекулярными особенностями

Сравнивая различные молекулярные характеристики в горячих и холодных опухолях, мы обнаружили сопоставимую мутационную нагрузку опухоли в обеих группах: 16,54 альтерации/МБ в горячих и 16,74 альтераций/МБ в холодных опухолях. Оценка EMT была в два раза выше при горячих опухолях (14,65 ± 0,72, холодные против 31,89 ± 0,52, горячие, нс). Что касается мутационного ландшафта моделей NSCLC PDX, горячие опухоли демонстрируют более высокую частоту мутаций в генах ERB2, KRAS и MET, тогда как холодные опухоли имеют более высокую частоту мутаций MYCL, PTEN, RB1 и TSC2. Исследование уровней экспрессии РНК одного и того же набора генов подтвердило более чем двукратные различия в средних уровнях экспрессии четырех генов: EGFR (р<0,005) и ROS1 (н.с.), тогда как MYCL (р<0,04) и MYCN (н.с.) показали более высокие уровни экспрессии в холодных опухолях (онлайн-дополнительная фигура 4).

Экспрессия белка PD-L1 на опухолевых клетках связана с плотностью инфильтрирующих иммунных клеток человека и huNSG соответственно (фиг. 3А). Влияние присутствия иммунных клеток человека определяли путем расчета кратности изменения площади DAB + в гуманизированных условиях по сравнению с негуманизированными на модель. В горячих опухолях было обнаружено более чем трехкратное увеличение экспрессии PD-L1.

Напротив, большинство холодовых опухолей подавляли PD-L1 в присутствии иммунных клеток человека (рис. 3В). Горячие опухоли экспрессировали значительно больше PD-L1, чем холодные опухоли, измеренные по площади DAB+ (рис. 3C; p<0,0071).

Рисунок 3

Экспрессию PD-L1 определяли с помощью ИГХ в 14 различных PDX НМРЛ в присутствии или в отсутствие иммунных клеток человека. (A) Были подготовлены сканы всего слайда, и из сканов были извлечены репрезентативные файлы JPEG с 10-кратным увеличением (включая масштабную линейку). Количественная оценка экспрессии PD-L1, определенная с помощью IHC на панели из 14 моделей NSCLC PDX, семи холодных и семи моделей горячей опухоли. Площадь DAB + определяли с использованием программного обеспечения OSANO путем анализа одного предметного стекла на модель опухоли в присутствии и в отсутствие иммунных клеток человека (всего 28 стекол) (B). Влияние присутствия иммунных клеток человека в мышином хозяине было определяется путем расчета кратного изменения площади DAB + в гуманизированной по сравнению с негуманизированной установкой для каждой модели и отображается в виде тепловой карты. (C) Сравнение экспрессии PD-L1, представленной как относительная площадь DAB + (= процент анализируемой площади) на холодных и горячих опухолях. Отдельные точки данных отображаются в виде диаграмм с минимумом и максимумом в виде усов, а медиана отображается в виде линии в рамке. (D) С использованием полных изображений слайдов, окрашенных гематоксилин-эозином, процентное содержание классов тканей опухоли, стромы и некроза было измерено с помощью алгоритма классификации тканей в 14 моделях NSCLC PDX, размноженных в гуманизированных NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ, семи холодных и семи модели горячей опухоли. Результаты представлены в процентах от анализируемой площади. Для каждой модели анализировали одно полное сканирование предметного стекла (n=7 для холодных и горячих опухолей соответственно). Отдельные точки данных отображаются в виде диаграмм с минимумом и максимумом в виде усов, а медиана отображается в виде линии в рамке. (E) С использованием полных изображений слайдов, окрашенных гематоксилин-эозином, с помощью алгоритма классификации тканей был измерен процент тканей классов опухоли, стромы и некроза у 52 пациентов с образцами НМРЛ, 34 холодных и 18 горячих моделей опухолей. Результаты представлены в процентах от анализируемой площади. Для каждой модели анализировали одно полное сканирование предметного стекла (n=34 для холодных и n=18 для горячих опухолей соответственно). Отдельные точки данных отображаются в виде диаграмм с минимумом и максимумом в виде усов, а медиана отображается в виде линии в рамке. DAB, 3,3'-диаминобензидин; ИГХ, иммуногистохимия; LXFA, ксенотрансплантат рака легкого Фрайбург, аденокарцинома; LXFE, ксенотрансплантат рака легкого Фрайбург, эпителиальный; LXFL, ксенотрансплантат рака легкого Фрайбург, крупноклеточный; НМРЛ, немелкоклеточный рак легкого; PD-L1, лиганд 1 запрограммированной гибели клеток; PDX, ксенотрансплантат, полученный от пациента.

Холодные опухоли демонстрируют более высокое соотношение опухоль/строма, чем горячие опухоли

Мы определили распределение трех основных классов тканей: опухоли, стромы и некроза, в нашей панели NSCLC PDX. Во-первых, мы исследовали вариабельность распределения классов тканей по одному блоку. Мы проанализировали пять блоков различных необработанных моделей NSCLC PDX, следуя схеме, изображенной на дополнительном онлайн-рисунке 5A, и нанесли состав ткани на разные слайды (онлайн-дополнительный рисунок 5B). В качестве меры неоднородности по всему блоку мы сравнили среднее соотношение опухоль/некроз и среднее соотношение опухоль/строма одного предметного стекла со средним значением полного стека (дополнительная онлайн-таблица 6). Процентное соотношение опухоли и стромы в пределах одного предметного стекла было стабильным по всему блоку и специфичным для определенной модели опухоли. Напротив, процент некроза варьировал по всему блоку для некоторых моделей, а именно LXFL 1674 и ксенотрансплантата рака легкого Freiburg, эпителиальный (LXFE) 2324. И наоборот, увеличение некроза было связано с соответствующим уменьшением опухолевой ткани. Мы пришли к выводу, что срезы ткани для этого типа анализа предпочтительно должны быть приготовлены из центральных частей опухоли, так как эти области были с наименьшей дисперсией среди различных моделей.

После систематической оценки надежности нашего рабочего процесса мы исследовали одно целое изображение слайда (WSI) для каждого параметра из середины отдельного блока в последующих анализах. Сравнение состава ткани во всех 14 моделях показало, что опухолевая ткань представляет собой наиболее заметный класс тканей. Холодные опухоли отображали меньше стромы, чем горячие опухоли, что приводило к статистически значимой разнице между опухолью класса ткани и стромой, особенно в группе холодных опухолей (рисунок 3D, p<0,001). Следует отметить, что разница между содержанием стромы в холодных и горячих опухолях не была статистически значимой.

Соответствующий анализ был проведен на клинических образцах от 52 пациентов с НМРЛ. Подгруппирование холодных и горячих опухолей было построено на основе количественного определения CD45 + клеток на основе анализа изображений. В соответствии с анализом FC образцов, полученных из моделей PDX, разница между TIL в горячих и холодных опухолях была статистически значимой (онлайн-дополнительная фигура 5C, p<0,0001). Более того, состав ткани в клинических образцах был очень похож на состав, наблюдаемый на панели PDX. В соответствии с этим разница между классами тканей опухоли и стромы была более заметной в холодных опухолях по сравнению с горячими опухолями (рис. 3E, p<0,0001 и p<0,0025).

Холодные опухоли несколько более чувствительны к лечению ингибиторами контрольных точек, чем горячие опухоли

Оба ингибитора контрольных точек замедляли рост опухоли при монотерапии и комбинированной терапии в 14 моделях в разной степени (рис. 4А). Во всех моделях комбинированное лечение было наиболее эффективным, за ним следует только лечение антицитотоксическим Т-лимфоцит-ассоциированным белком 4 (CTLA-4) (p<0,012 и p<0,035 соответственно). Это справедливо при исследовании именно холодовых опухолей (p<0,024 и p<0,045 соответственно). Напротив, в группе горячих опухолей относительные объемы опухолей в разных группах лечения существенно не различались. Эти результаты были подтверждены изучением значений T/C в последний день эксперимента: во всех группах лечения три холодные, но только две горячие опухоли можно было определить как ответившие (значение T/C <50% частичной ремиссии, рисунок 4B). .

Рисунок 4

Чувствительность к лечению ингибиторами контрольных точек NSCLC PDX при монотерапии и комбинированной терапии была протестирована на 14 моделях NSCLC PDX в формате исследования на одной мыши. (A) Относительный объем опухоли в последний день эксперимента с объемом опухоли, измеренным в первый день лечения, установленным за 100%, был нанесен на график для различных групп лечения. Каждая точка представляет одно животное с другой моделью NSCLC PDX. Линия указывает медиану соответствующей группы. Статистические данные, выделенные темно-серым цветом, представляют собой анализ всех опухолей в группе лечения (горячее и холодное). (B) Тестовое/контрольное значение в последний день эксперимента было нанесено на график для каждой группы лечения отдельно для холодных и горячих опухолей. Каждая точка представляет одну опухоль. Линия указывает медиану соответствующей группы. Пунктирная линия отмечает тестовое/контрольное значение 50%, указывающее пороговое значение для ответившего по сравнению с неответившим. CTLA-4, цитотоксический белок 4, ассоциированный с Т-лимфоцитами; НМРЛ, немелкоклеточный рак легкого; PD-1, запрограммированная гибель клеток 1; PDX, ксенотрансплантат, полученный от пациента.

Лечение ингибиторами контрольных точек повышало уровень TIL преимущественно в холодных опухолях

При лечении ингибиторами контрольных точек популяция иммунных клеток увеличивалась в основном в холодных опухолях, тогда как в горячих опухолях наблюдалось менее выраженное увеличение инфильтрации иммунных клеток. Таким образом, разница в процентном содержании CD45+, определяющая горячие и холодные опухоли у нелеченых животных, была уменьшена до такой степени, что только в группе, получавшей анти-CTLA-4, это значение отражало статически значимую разницу (p<0,041, фигура 5A). ). Следует отметить, что в наиболее эффективной группе комбинированного лечения процент клеток CD45+/CD8+ был значительно выше в горячих опухолях (p<0,029)., множественные t-тесты). Чтобы лучше понять влияние лечения на инфильтрацию иммунных клеток, мы нанесли на график кратность изменений между необработанной и соответствующей группой лечения для различных типов иммунных клеток в холодных и горячих опухолях (рис. 5B). Стало очевидным, что, хотя различия в абсолютных значениях не были очевидны, именно холодовые опухоли демонстрировали заметное относительное увеличение инфильтратов иммунных клеток при лечении. Очевидно, активированные клетки CD4 + и CD8 +, а также соотношение CD4/CD8 были увеличены более чем в 100 раз в холодных опухолях. Параллельно лечение против запрограммированной клеточной гибели 1 (PD-1) снижало уровень CD45+клеток до 56% и активированных CD8+клеток до 59%.% необработанного контроля. Исследование кроветворных органов не выявило явных различий инфильтратов иммунных клеток человека во всех условиях (онлайн-дополнительный рисунок 6A, B).

Рисунок 5

(A) Анализ проточной цитометрией иммунных клеток человека в опухоли гуманизированных мышей NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ, несущих опухоль, в последний день эксперимента. В общей сложности 42 животных с 14 различными моделями ксенотрансплантатов, полученных от пациентов, были отнесены к разным группам лечения и проанализированы на предмет инфильтрации иммунными клетками человека. Отдельные точки данных отображаются в виде диаграмм с минимумом и максимумом в виде усов, а медиана отображается в виде линии в рамке. Разница между холодными и горячими опухолями была значимой для CD45 + в группе, получавшей изотипический контроль или лечение анти-CTLA-4, и для CD8 + клеток в группе комбинированного лечения (p<0,00013, p<0,041 и p<0,029)., множественные t-тесты). (B) Кратность изменения различных популяций иммунных клеток по сравнению с соответствующей необработанной контрольной группой была рассчитана для каждого отдельного эксперимента и модели. Средние значения кратности изменений для холодных и горячих опухолей были построены в виде тепловой карты. (C) Секреция цитокинов и хемокинов человека горячими и холодными опухолями при лечении различными CPi. Изменения кратности для холодных и горячих опухолей были нанесены на график в виде гистограммы со средним значением и SE среднего значения. Изменения кратности >2 выделены красным цветом, изменения кратности <0,5 выделены синим цветом. Для каждого аналита был проведен парный t-критерий отношения для определения статистической значимости между абсолютными значениями необработанного контроля и соответствующей группы лечения. (D) Уровни мышиного G-CSF в горячих опухолях при лечении различными CPi. Абсолютные значения мышиного G-CSF были построены в виде графика до и после для трех различных групп лечения. Для определения статистической значимости между абсолютными значениями необработанного контроля и соответствующей группы лечения был проведен парный t-критерий соотношения. CPi, ингибитор контрольной точки; CTLA-4, цитотоксический белок 4, ассоциированный с Т-лимфоцитами; G-CSF, фактор стимуляции колоний гранулоцитов; ИЛ, интерлейкин; ИФН, интерферон; PD-1, запрограммированная гибель клеток 1; TIL, опухоль-инфильтрирующие лимфоциты; TNF, фактор некроза опухоли.

Горячие и холодные опухоли демонстрировали явный набор цитокинов при лечении ингибиторами контрольных точек

Цитокины человека регулировались по-разному в зависимости от характеристик опухоли и группы лечения (рис. 5C). В холодных опухолях лечение анти-CTLA4 индуцировало повышенную регуляцию CXCL13, что, среди прочего, наблюдалось в группе горячих опухолей. Монотерапия анти-PD-1 не влияла на цитокиновый профиль холодовых опухолей человека. Напротив, наиболее эффективная комбинированная группа индуцировала активацию CCL17, CCL20 и CCL26 (все н.с.). В группе горячих опухолей монотерапия анти-CTLA-4 индуцировала увеличение экспрессии CXCL13 (p<0,037), а также повышение уровня CXCL9.(p<0,02) и MIF (н.с.). Напротив, лечение анти-PD-1 привело к снижению четырех цитокинов: CXCL9 (p<0,04), CXCL13 (p<0,047), CCL8 (p<0,04) и IL-16 (p<0,012). Лечение комбинированным ингибитором контрольной точки (CPi) приводило к увеличению CXCL9, CXCL10 и CXCL11 в опухолевой ткани (все н.с.). Экспрессия мышиного фактора стимуляции колоний гранулоцитов (G-CSF) была модулирована в группе горячих опухолей (фигура 5D). Лечение анти-CTLA-4 индуцировало повышение уровней G-CSF в горячих опухолях, что приводило к среднему кратному изменению в 2,6 раза для монотерапии и 3,4 в группе комбинированной терапии (все н. у.). На характер экспрессии других мышиных цитокинов лечение не оказало заметного влияния: кратность изменения колебалась от 0,6 до 1,9.(дополнительный онлайн рисунок 7).

Экспрессия PD-L1 модулируется обратно пропорционально в холодных и горячих опухолях при лечении ингибиторами контрольных точек -1 или их комбинация (фиг.6А). В целом, лечение CPi индуцировало повышение экспрессии PD-L1 в холодных опухолях, тогда как в горячих опухолях наблюдалось умеренное снижение экспрессии. Абсолютная экспрессия PD-L1 была значительно выше в горячих опухолях, чем в холодных опухолях необработанных рук (p

<0,008). Модуляция экспрессии PD-L1 при лечении CPi уменьшала разницу в уровне экспрессии до незначительного уровня (фиг. 6B). Сравнение кратности изменений в группе холодной и горячей опухоли для применяемого режима лечения выявило статистически значимые различия со значениями p<0,018 (анти-CTLA-4), p<0,014 (анти-PD-1) и p <0,008 для комбинации (фигура 6C). Следует отметить, что ни кратность изменения при лечении, ни уровень экспрессии PD-L1 в необработанных опухолях не были предикторами реакции на какое-либо из исследованных методов лечения (онлайн-дополнительная фигура 8).

Рисунок 6

Экспрессию PD-L1 определяли с помощью ИГХ в 14 различных PDX НМРЛ в присутствии иммунных клеток человека и при лечении двумя различными ингибиторами контрольных точек при монотерапии и комбинированной терапии. Площадь DAB + определяли с использованием программного обеспечения OSANO путем анализа одного цельного предметного стекла на модель опухоли и настройки: гуманизированное необработанное, гуманизированное лечение анти-CTLA-4, гуманизированное лечение анти-PD-1 и гуманизированное комбинированное лечение, всего 56 слайдов. (A) Репрезентативные файлы JPEG с 10-кратным увеличением были извлечены из сканов (включая масштабную линейку) для одной холодной и одной горячей модели опухоли в разных группах лечения. (B) Кратность изменения экспрессии PD-L1 по сравнению с соответствующим необработанным контролем рассчитывали для каждой модели и наносили на график отдельно для холодных и горячих опухолей. Отдельные точки данных отображаются в виде диаграмм с минимумом и максимумом в виде усов, а медиана отображается в виде линии в рамке. Пунктирная линия a y=1 изображает точку перегиба от понижения (<1) к повышению (>1) PD-L1. (C) Абсолютные значения экспрессии PD-L1, представленные как относительная площадь DAB + (= процент анализируемой площади) в различных группах лечения, были нанесены отдельно для холодных и горячих опухолей. Отдельные точки данных отображаются как графики скрипки с отдельными точками данных. (D) С использованием полных изображений предметных стекол, окрашенных гематоксилин-эозином, процентная доля опухолей, стромы и некроза классов тканей была измерена с помощью алгоритма классификации тканей в 14 моделях NSCLC PDX. Классы тканей для холодных и горячих опухолей в различных группах лечения представлены в процентах от анализируемой площади. Для каждой модели и каждой лечебной группы было проанализировано одно полное сканирование предметного стекла (n=7 для холодных и горячих опухолей соответственно). Отдельные точки данных отображаются в виде диаграмм с минимумом и максимумом в виде усов, а медиана отображается в виде линии в рамке. CTCLA-4, цитотоксический белок 4, ассоциированный с Т-лимфоцитами; DAB, 3,3'-диаминобензидин; LXFA, ксенотрансплантат рака легкого Фрайбург, аденокарцинома; PD-1, запрограммированная гибель клеток 1; PD-L1, лиганд 1 запрограммированной гибели клеток; НМРЛ, немелкоклеточный рак легкого; PDX, ксенотрансплантат, полученный от пациента.

Распределение трех основных классов тканей было изменено при лечении CPi

Лечение CPi’ оказало различное влияние на долю трех основных классов тканей опухоли, стромы и некроза. В холодных опухолях соотношение между тремя классами было стабильным во всех группах лечения. В горячих опухолях лечение анти-CTLA-4 уменьшало содержание стромы, увеличивая процент площади опухоли. Кроме того, лечение анти-PD-1 вызывало уменьшение некроза, что также верно для комбинированного лечения (рис. 6D).

Обнаружение TIL на основе IHC с использованием анализа изображения всего предметного стекла отражает результаты FC тестирования SMT

Чтобы дополнить наш набор данных с использованием клинически значимой технологии, мы определили инфильтрацию CD45 + клеток человека с помощью IHC. Как и при количественной оценке класса ткани, мы исследовали гетерогенность инфильтрата иммунных клеток на протяжении одного блока в пяти репрезентативных моделях NSCLC PDX. В качестве меры гетерогенности по блоку мы нанесли на график средний процент (±SD) иммунных клеток на предметных стеклах по сравнению со средним процентом (±SD) всего блока. Несмотря на LXFE 2324, среднее значение отдельного предметного стекла находилось в пределах стандартного отклонения всего стека (рис. 7А). Опять же, после этапа проверки мы исследовали один WSI для каждой настройки во всех последующих анализах. Сравнение процентной доли площади DAB + ядра в качестве показателя инфильтратов иммунных клеток подтвердило данные FC 14 моделей NSCLC PDX (рис. 7B). Разница в инфильтратах иммунных клеток между холодными и горячими опухолями была статистически значимой в необработанной ткани. В частности, при лечении анти-PD-1 разница между двумя группами стала менее заметной. По аналогии с данными FC мы сравнили кратное изменение инфильтратов иммунных клеток человека в различных группах лечения при холодовых и горячих опухолях (рис. 7C). Хотя изменения были более тонкими по сравнению с анализом FC, тенденция была очень похожей: инфильтраты иммунных клеток увеличивались в первую очередь в холодных опухолях при лечении ингибиторами контрольных точек, в то время как они оставались стабильными или даже уменьшались в горячих опухолях.

Рисунок 7

С использованием изображений цельных слайдов иммуногистохимических препаратов, окрашенных DAB против CD45, присутствие CD45+клеток на слайде определяли количественно как процент площади ядер, положительных по DAB, от общей площади ядер. (A) Для пяти образцов из необработанного ксенотрансплантата, полученного от пациента с немелкоклеточным раком легкого, был проанализирован полный пакет, как описано в M&M, и был нанесен средний процент и стандартное отклонение частичных пакетов по сравнению со средним процентом и стандартным отклонением полного пакета. (B) Процент окрашенной DAB CD45-положительной области по отношению к полной площади образца для холодных и горячих опухолей в различных группах лечения нанесен как процент анализируемой площади. Для каждой модели и каждой лечебной группы было проанализировано одно полное сканирование предметного стекла (n=7 для холодных и горячих опухолей соответственно). Отдельные точки данных отображаются в виде диаграмм с минимумом и максимумом в виде усов, а медиана отображается в виде линии в рамке. (C) Кратность изменения инфильтрации CD45 + клеток, определяемая процентом площади DAB +, по сравнению с соответствующей необработанной контрольной группой, рассчитывалась для каждого отдельного эксперимента и модели. Средние значения кратности изменений для холодных и горячих опухолей были построены в виде тепловой карты. CTLA-4, цитотоксический белок 4, ассоциированный с Т-лимфоцитами; DAB, 3,3'-диаминобензидин; LXFA, ксенотрансплантат рака легкого Фрайбург, аденокарцинома; LXFE, ксенотрансплантат рака легкого Фрайбург, эпителиальный; LXFE, ксенотрансплантат рака легкого Фрайбург, эпителиальный.

Обсуждение

Появление иммуноонкологии произвело революцию в лечении рака. опухоли и их микроокружение. Идентификацию потенциальных маркеров стратификации, оценку возможных комбинированных терапий и идентификацию новых мишеней необходимо начинать в доклиническом периоде. Хотя сингенные модели обладают неоспоримыми преимуществами, потребность в модели in vivo, экспрессирующей специфические для человека мишени в перекрестных помехах с иммунными клетками человека, является необходимостью. как два золотых стандарта для онкологии и иммунологии. На панели из 14 NSCLC PDX можно было идентифицировать горячие и холодные опухоли, сходные с клиническими условиями.29В соответствии с данными клинических исследований у пациентов с НМРЛ было обнаружено, что подтипы Т-клеток демонстрируют очень похожее распределение в обоих классах. 30 Интересно, что процент естественных клеток-киллеров был одинаково низким в холодных и горячих опухолях, что также имитировало клиническую картину. ситуация (рис. 2A).31, 32 Кроме того, пять из семи биомаркеров были по-разному экспрессированы в горячих и холодных опухолях: уровни цитокинов (рис. 2B), экспрессия PD-L1 и соотношение опухоль/строма (рис. 3), оценка EMT (онлайн дополнительная фигура 4) и васкуляризация (дополнительная онлайн-таблица 4). Терапевтический эксперимент в формате SMT выявил характер ответа, очень сравнимый с клиникой (рис. 4).24, 33 Ни один из исследованных биомаркеров не был предиктором лечения CPi. Тем не менее, модели опухолей продемонстрировали уникальную характеристику при лечении в зависимости от их скорости TIL (рис. 5–7). Опять же, это отражает клиническую ситуацию, когда прогностический биомаркер еще не определен, и наблюдается тенденция к определению исключающих биомаркеров, связанных с отсутствием пользы и/или риском побочных эффектов.1, 2, 34, 35 Интеграция различных показаний является одним из преимуществ. доклинических условий, чтобы улучшить возможность раннего выявления прогностических биомаркеров.

Способность панелей PDX отражать картину болезни хорошо описана нами и другими группами. иначе описательный признак. Тот факт, что FC в качестве золотого стандарта в доклинической онкологии и анализ изображений WSI в качестве считывания, применимого в рутинной клинической диагностической обстановке, привел к тем же выводам, что подчеркивает трансляционную ценность платформы. Трансляционное значение самого инструмента анализа изображений было подтверждено на панели образцов НМРЛ человека из несвязанной когорты, что подтвердило надежность алгоритма глубокого обучения (рис. 3E, дополнительная онлайн-рис. 5C). Хотя значимость показателя TIL как прогностического маркера восприимчивости к лечению ХПН еще предстоит полностью выяснить,38 тот факт, что первый показатель может быть определен как имманентный признак модели, аналогичный молекулярному строению или гистологической архитектуре конкретного PDX. подтверждает роль этих моделей в качестве золотого стандарта в условиях иммуноонкологии. Лечение ИПН превратило иммунологически «холодные» опухоли в «горячие», что объясняет более высокую чувствительность к лечению в первой группе. Повышенная активность комбинированного лечения CPi является убедительным показателем, подтверждающим это предположение.23 Остается выяснить, могут ли «холодные» опухоли, определенные в этом исследовании на основе плотности TIL, состоять из смеси «холодных», «иммунных» исключены» и «опухоли с иммуносупрессией/иммунной пустыней».

Использование моделей PDX неизбежно ставит вопрос о том, как справиться с внутриопухолевой гетерогенностью.5 39 В нашем исследовании мы определили степень гетерогенности в пределах одной опухоли путем анализа распределения трех основных классов тканей и распределения CD45+ по всему образцу опухоли (рис. 7, дополнительная онлайн-рис. 5B). Эта стратегия валидации позволяет использовать PDX в доклинических исследованиях ввода-вывода и повышает надежность маркеров IHC в качестве поступательного считывания в доклинических исследованиях. Поскольку большая часть сопутствующей диагностики для стратификации пациентов основана на ИГХ, это подразумевает стратегическое преимущество, позволяющее облегчить переход инновационных препаратов из доклинического пространства в раннее клиническое. надежность системы зависит не только от характеристик модели, но и от целевого паттерна экспрессии.40, 41,

Насколько нам известно, это первый случай систематической оценки осуществимости SMT в иммуноонкологических условиях с использованием инструментов компьютерной патологии, интегрированных с иммунологическим (цитокиновым) профилированием. 12 Преимущества этого формата скрининга вступили в силу. при тестировании иммуномодулирующих соединений в такой же степени, как описано выше для традиционных онкологических препаратов.42 Первоначально разработанная как платформа для скрининга in vivo,4 SMT в сочетании с функциональными показаниями может обеспечить механистическое понимание механизма действия и поддержать разработку прогностические биомаркеры. Тот факт, что не было прямой корреляции между уровнем экспрессии PD-L1 в опухолевой ткани и чувствительностью к лечению CPi, согласуется с наблюдениями клинических групп, которые стремятся разработать биомаркеры для стратификации пациентов с НМРЛ и другими типами рака.2,43– 45

Использование больших панелей цитокинов для функционального анализа оказалось очень многообещающим. Увеличение CCL26 при наиболее эффективном комбинированном лечении, скорее всего, может быть связано с усилением гипоксии, поскольку клетки, экспрессирующие этот хемокин независимо от гипоксии, отсутствуют в модели huNSG. 46 Эта гипотеза дополнительно подтверждается тем фактом, что процент некроза особенно увеличивается при холодовых опухолях в группе комбинированного лечения. Биологические последствия повышенных уровней CXCL13 при лечении CTLA-4 не могут быть полностью выяснены, поскольку компартмент супрессорных клеток миелоидного происхождения, являющийся мишенью для этого хемокина, сильно недопредставлен в модели huNSG (рис. 5C,D).47 При параллельной оценке уровней цитокинов мыши и человека можно было различать цитокины, полученные из опухолевых или иммунных клеток человека, и из микроокружения опухоли, отличной от человека. Видоспецифичность соответствующих платформ позволила устранить эту очень сложную взаимосвязь.48–50 Хотя знания о перекрестной реактивности цитокинов человека и мыши и их рецепторов фрагментарны, важно подробно охарактеризовать животную модель. При систематическом анализе моделей мышей в различных условиях интерпретация результатов приобретет трансляционную ценность.51, 52,

В совокупности успешная разработка биомаркеров для иммуноонкологии требует глубокого понимания механизма и понимания экспрессии биомаркеров в контексте механизма действия. Модели PDX в huNSG обладают высоким потенциалом для устранения этого разрыва между доклиническими испытаниями эффективности и клинической разработкой ранней сопутствующей диагностики.

Заявление о доступности данных

Полное секвенирование экзома, секвенирование РНК и отсканированные изображения доступны в общедоступном хранилище с открытым доступом. Запрос алгоритма анализа изображения предоставляется по обоснованному запросу. Все данные, непосредственно относящиеся к исследованию, включены в статью или загружены в качестве дополнительной информации. Данные RNASeq и целого экзома Seq доступны через https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra, данные изображений модели PDX доступны через IDR (https://idr.openmicrooscopy.org/tissue/). Все дополнительные данные, относящиеся к исследованию, либо загружаются в качестве дополнительной информации, либо могут быть запрошены у старших авторов JS (модели животных), FF (цифровая и обычная патология) или DM (цифровая патология/анализ изображений).

Благодарности

Мы благодарим Николь Кронке за отличную техническую помощь и Хагена Клетта за ИТ-поддержку.

Каталожные номера

1. ↵
   1. Camidge DR,
   2. Doebele RC,
   3. Kerr KM

   . Сравнение и противопоставление прогностических биомаркеров для иммунотерапии и таргетной терапии НМРЛ. Nat Rev Clin Oncol 2019;16:341–55.doi:10.1038/s41571-019-0173-9pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30718843

2. ↵
   1. Ким Х.,
   2. Квон Х.Дж.,
   3. Ким Э.С. и др.

   . Сравнение прогностической способности комбинированного и индивидуального тестирования биомаркеров у пациентов с немелкоклеточным раком легкого, получавших ингибиторы иммунных контрольных точек. Противораковая терапия 2021:583.doi:10.4143/crt.2021.583pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/34237208

3. ↵
   ,
   2. Tan32 Tantler JJ,
   3. Weekes CD и др.

   . Опухолевые ксенотрансплантаты, полученные от пациентов, как модели для разработки онкологических препаратов. Nat Rev Clin Oncol 2012;9:338–50.doi:10.1038/nrclinonc.2012.61pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22508028

4. ↵
   1. Мильярди Г.,
   2. Галими Ф. и др.

   . Молекулярно аннотированная платформа ксенотрансплантатов, полученных от пациентов («ксенопациенты»), идентифицирует HER2 как эффективную терапевтическую мишень при цетуксимаб-резистентном колоректальном раке. Рак Discov 2011;1:508–23.doi:10.1158/2159-8290.CD-11-0109pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22586653

   1. ↵
   2. 4
      Бруна А.,
      1. Руэда О.М.,
      2. Гринвуд В. и др.

      . Биобанк эксплантатов рака молочной железы с сохраненной внутриопухолевой гетерогенностью для скрининга противоопухолевых соединений. Cell 2016;167:260–74.doi:10.1016/j.cell.2016.08.041pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27641504

   3. ↵
      1. Идальго М.,
      2. Амант Ф.,
      3. Бьянкин А.В. и др.

      . Модели ксенотрансплантатов пациентов: новая платформа для трансляционных исследований рака. Cancer Discov 2014;4:998–1013.doi:10.1158/2159-8290.CD-14-0001pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25185190

   4. ↵
   5. 4 Conte N,
   6. Mason JC,
   7. Halmagyi C, и др.

   . Поиск PDX: портал для обнаружения модели ксенотрансплантата опухоли, полученной от пациента. Nucleic Acids Res 2019;47:D1073–9.doi:10.1093/nar/gky984pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30535239

5. ↵ 5

   Gao Korn JM,

   1. Ferretti S, и др.

   . Высокопроизводительный скрининг с использованием ксенотрансплантатов опухолей, полученных от пациентов, для прогнозирования ответа на лекарственные препараты в клинических испытаниях. Nat Med 2015;21:1318–25.doi:10.1038/nm.3954pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26479923

6. ↵
   1. Pan E,
   2. Богумил D,
   3. Cortessis V и др.

   . Систематический обзор эффективности доклинических моделей лекарств от рака легких. Front Oncol 2020; 10: 591.doi: 10.3389/fonc.2020.00591PMID: http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/323

7. etshmed/323

8. ↵

   3

13

3

3

3

3

3

3

3

3

3

3

3

3

3

. Трансляционное исследование: 4 способа исправить клиническое исследование.

Nature 2011;477:526–8.doi:10.1038/477526apmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21956311
9. ↵
   1. Маллард А

   . 2013 год в размышлениях. Nat Rev Drug Discov 2014;13:5–7.doi:10.1038/nrd4218pmid:http://www.ncbi.nlm. nih.gov/pubmed/24378784

10. ↵
    1. De La Rochere2,
    2. Guil-Luna S,
    3. Decaudin D и др.

    . Гуманизированные мыши для изучения иммуноонкологии. Trends Immunol 2018;39:748–63.doi:10.1016/j.it.2018.07.001pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30077656

11. ↵
    1. Капассо А,
    2. Ланг Дж.,
    3. Питтс ТМ и др.

    . Характеристика иммунных ответов на моно- и комбинированную иммунотерапию против PD-1 у гемопоэтических гуманизированных мышей с имплантированными опухолевыми ксенотрансплантатами. J Immunother Cancer 2019;7:37.doi:10.1186/s40425-019-0518-zpmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30736857

12. ↵
    Rongvaux A,
    1. Такидзава Х.,
    2. Стровиг Т. и др.

    . Мыши с гемато-лимфоидной системой человека: текущее использование и будущий потенциал для медицины. Annu Rev Immunol 2013; 31: 635–74. M,

13. Yao LC,
14. Cheng M, и др.

. Гуманизированные мыши в изучении эффективности и механизмов иммунотерапии рака, нацеленного на PD-1. Фасеб Дж. 2018; 32: 1537–49.doi: 10.1096/fj.201700740rpmid: http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2

34

↵

1. YIN L,
2. WANG x-J-j-j-j-j-j-j-j-j-j-j-j-j-j-j-j-j-j-j-j-j-r,
   28. .

       . Модель гуманизированной мыши: обзор доклинических применений иммунотерапии рака. Am J Cancer Res 2020;10:4568–84.pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/33415020

   29. ↵

       Анализ иммуногистохимически окрашенных изображений цельного препарата карциномы яичника . Берлин, Гейдельберг. Springer Берлин Гейдельберг 2017.

   30. ↵
       1. Баг Д,
       2. Фейерхейк Ф,
       3. Освальд Э и др.

       . Полуавтоматический анализ цифровых цельных слайдов из гуманизированных моделей ксенотрансплантата рака легкого для прогнозирования ответа ингибитора контрольной точки. Oncotarget 2019; 10: 4587–97.doi: 10.18632/oncotarget.27069pmid: http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3136066

   925555.
   kmed/313603 ,
   1. Комуров К и др.

   . Сигнатура экспрессии гена интерактома перехода основного эпителия в мезенхиму связана с подтипами рака молочной железы с низким уровнем клаудина и метапластическим раком. Proc Natl Acad Sci U S A 2010;107:15449–54.doi:10.1073/pnas.1004

   7pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20713713

   ↵4, Rudis 9090 ↵4

   31. Dewhurst MR,
   32. Horga LG и др.

   . Высокий показатель сигнатуры EMT для клеток инвазивного немелкоклеточного рака легкого (NSCLC) коррелирует с секрецией колониестимулирующего фактора 2 (CSF2/GM-CSF), управляемого NFκB, соседними стромальными фибробластами. PLoS One 2015;10:e0124283.doi:10.1371/journal.pone.0124283pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25

3. 0

4. ↵ 5 Williams
6. Ed 092 SF
   П,
   1. Томило М

   . Abstract 3665: диагностика экспрессии гена EMT предсказывает резистентность к EGFR и MEK-таргетным методам лечения у клеточных линий и пациентов. Cancer Res 2012; 72:3665–65.

   1. ↵
      1. Кузен-Франкель Дж.

      . Иммунотерапия рака. Наука 2013;342:1432–3.doi:10.1126/science.342.6165.1432

   2. ↵
      1. Галон J,
      2. Бруни D
         9 1111399 1111399
   6011117

7. Подходы к лечению иммунных горячих, измененных и холодовых опухолей с помощью комбинированной иммунотерапии. Nat Rev Drug Discov 2019;18:197–218.doi:10.1038/s41573-018-0007-ypmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30610226

8. 25 9000 Халлквист А,
9. Ролин А,
10. Рагхаван С

. Блокада иммунных контрольных точек и биомаркеры клинического ответа при немелкоклеточном раке легкого. Scand J Immunol 2020; 92: E12980.doi: 10.1111/sji.12980pmid: http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/33015859

arbmed/33015859

arbmed/33015859

arbmed/33015859.

. Сопутствующая и дополнительная диагностика сосредоточена на анализе экспрессии PD-L1 для ингибиторов контрольной точки PD-1/PD-L1 при немелкоклеточном раке легкого. Ther Drug Monit 2018;40:9–16.doi:10.1097/FTD.0000000000000460pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/231

↵

S 2 9,

0 Khan Хан С. А.,

Луо Х и др.

. Иммунная дисрегуляция у онкологических больных с развитием побочных эффектов, связанных с иммунитетом. Br J Рак 2019;120:63–8.doi:10.1038/s41416-018-0155-1pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30377338

↵

4 90 Р,

Münz C,

Schuringa JJ и др.

. Инновации, проблемы и минимум информации для стандартизации гуманизированных мышей. EMBO Mol Med 2020;12:e8662.doi:10.15252/emmm.201708662pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32578942

↵

1. Ny L,
2. Rizzo LY ,
3. Бельграно В. и др.

. Поддержка принятия клинических решений при распространенной меланоме путем доклинических испытаний на персонализированных иммунно-гуманизированных моделях мышей с ксенотрансплантатом. Ann Oncol 2020;31:266–73. doi:10.1016/j.annonc.2019.11.002pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31959343

↵

Lizotte 90PH ,

Иванова Е.В.,

Авад М.М. и др.

. Многопараметрическое профилирование немелкоклеточного рака легкого выявляет различные иммунофенотипы. JCI Insight 2016;1:e89014.doi:10.1172/jci.insight.89014pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27699239

↵

1. Federico L,
2. McGrail DJ,
3. Bentebibel S-E, и др.

. Различные ландшафты инфильтрирующих опухоль лимфоцитов связаны с клиническими исходами при локализованном немелкоклеточном раке легкого. Ann Oncol 2022;33:42–56.doi:10.1016/j.annonc.2021.09.021pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/34653632

↵

4 90 J ,

Joubert P-E,

Gillard-Bocquet M, и др.

. Естественные клетки-киллеры в микроокружении опухоли легкого человека проявляют иммуноингибирующие функции. J Immunother Cancer 2020;8:e001054.doi:10.1136/jitc-2020-001054pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/33067317

↵ 9032

↵ 203

Bjørhovde HAK,
1. Skarshaug R, и др.

. Состав иммунных клеток при немелкоклеточном раке легкого человека. Front Immunol 2018;9:3101.doi:10.3389/fimmu.2018.03101pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30774636

1. ↵
   1. Graeser M,
   2. Feuerhake F,
   3. Gluz O и др.

   . Состав иммунных клеток и динамика функциональных маркеров по данным мультиплексной иммуногистохимии для прогнозирования ответа на неоадъювантную химиотерапию в исследовании WSG-ADAPT-TN. J Immunother Cancer 2021;9:e002198.doi:10.1136/jitc-2020-002198pmid:http://www. ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/33963012

2. ↵ 5 90 J 2 90 254 90,254 Бирембо П,
3. Девольф М. и др.

. Лиганд запрограммированной смерти 1 и виментин: тандемный маркер как прогностический фактор при НМРЛ. Cancers 2019;11:11101411.doi:10.3390/cancers11101411pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31546725

↵

1. Bai R,
2. Lv Z,
3. Xu Д и др.

. Прогностические биомаркеры для иммунотерапии рака ингибиторами иммунных контрольных точек. Biomark Res 2020;8:34.doi:10.1186/s40364-020-00209-0pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32864131

↵

1. Чо S-Y

. Ксенотрансплантаты, полученные от пациентов, как совместимые модели для прецизионной онкологии. Lab Anim Res 2020;36:14.doi:10.1186/s42826-020-00045-1pmid:http://www. ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32461927

↵ Schueler

90
1. Клингнер К.,
2. Баг Д. и др.

. Ксенотрансплантаты почечно-клеточной карциномы, полученные от пациентов, демонстрируют различные модели чувствительности в ответ на антиангиогенную терапию и представляют собой подходящий инструмент для разработки биомаркеров. Oncotarget 2018;9:30946–61.doi:10.18632/oncotarget.25697pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30123419

↵

0 5 Де Гильбон А,
1. Салдманн А и др.

. Помимо концепции холодных и горячих опухолей для разработки новых прогностических биомаркеров и рационального дизайна комбинации иммунотерапии. Int J Cancer 2020;147:1509–18.doi:10.1002/ijc.32889pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31997345

↵

1. Williams JA

. Использование PDX для доклинического открытия лекарств от рака: развивающаяся область. J Clin Med 2018;7:41.doi:10.3390/jcm7030041pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29498669

↵

2. Rizzardi AE
3. Фогель Р.И. и др.

. Количественное сравнение иммуногистохимического окрашивания, измеренного с помощью анализа цифрового изображения, с визуальной оценкой патологоанатома. Diagn Pathol 2012;7:42.doi:10.1186/1746-1596-7-42pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22515559

↵

Tewary S02, 0025
1. Арун И.,
2. Ахмед Р. и др.

. AutoIHC-Analyzer: компьютерная микроскопия для автоматизированной экстракции/оценки мембран в молекулярных маркерах HER2. J Microsc 2021;281:87–96.doi:10.1111/jmi.12955pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32803890

↵

1. Yao Y-MM,
2. Donoho GP,
3. Iversen PW и др.

. Испытание PDX на мышах предполагает синергизм одновременного ингибирования RAF и EGFR при колоректальном раке с мутациями BRAF или KRAS. Clin Cancer Res 2017;23:5547–60.doi:10.1158/1078-0432.CCR-16-3250pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28611205

↵ 9000

Berry S,

Giraldo NA,

Green BF и др.

. Анализ многоспектральных изображений с помощью платформы AstroPath сообщает об эффективности блокады PD-1. Science 2021;372:2609.doi:10.1126/science.aba2609pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/34112666

↵

1. Lu S,
   2
2. Римм Д.Л. и др.

. Сравнение методов биомаркеров для прогнозирования ответа на блокаду контрольной точки PD-1/PD-L1: систематический обзор и метаанализ. JAMA Oncol 2019;5:1195–204.doi:10. 1001/jamaoncol.2019.1549pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31318407

↵

1. Шахин С.,
2. Батур Шебнем,
3. Айдын Овгю и др.

. Запрограммированная экспрессия лиганда смерти-1 при немелкоклеточном раке легкого и прогноз. Balkan Med J 2019;36:184–9.doi:10.4274/balkanmedj.galenos.2018.2018.0392pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/305

24u 9u 9u DK-C,

Xu IM-J,

Lai RK-H и др.

. Гипоксия индуцирует рекрутирование супрессорных клеток миелоидного происхождения в гепатоцеллюлярную карциному через хемокиновый (мотив C-C) лиганд 26. Hepatology 2016;64:797–813.doi:10.1002/hep.28655pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27228567

↵

5 Jhou3 Q2,
1. ↵
   5 Jhou3 Q2, ,
   1. Джин М и др.

   . Гуманизированные мыши NOD-SCID IL2rg–/– в качестве доклинической модели для исследования рака и ее потенциального использования для индивидуальной терапии рака. Cancer Lett 2014;344:13–19.doi:10.1016/j.canlet.2013.10.015pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24513265

2. ↵
   1. Харрис Г.,
   2. Чен В.

   . Профилирование ответов цитокинов и хемокинов с использованием технологии мультиплексной матрицы бусинок. Methods Mol Biol 2019;2024:79–94.doi:10.1007/978-1-4939-9597-4_4pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31364043

3. ↵ 9000
4. Manglani M,
5. Rua R,
6. Hendricksen A, и др.

. Метод количественного определения цитокинов и хемокинов в ткани головного мозга мыши с использованием мультиплексных иммуноанализов Bio-Plex. Methods 2019;158:22–6.doi:10.1016/j.ymeth.2019.02.007pmid:http://www. ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30742997

↵

1. Morgan E
2. Варро Р.,
3. Сепульведа Х. и др.

. Массив цитометрических шариков: платформа мультиплексного анализа с приложениями в различных областях биологии. Clin Immunol 2004;110:252–66.doi:10.1016/j.clim.2003.11.017pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15047203

↵

1. Ландграф М.,
2. Макговерн Дж.А.,
3. Фридл П. и др.

. Рациональный дизайн моделей мышей для исследования рака. Trends Biotechnol 2018;36:242–51.doi:10.1016/j.tibtech.2017.12.001pmid:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29310843

↵

4

. Доклинические исследования: заставьте исследования на мышах работать. Nature 2014;507:423–5.doi:10.1038/507423apmid:http://www.ncbi. nlm.nih.gov/pubmed/24678540

Дополнительные материалы

• Дополнительные данные

  Этот веб-файл был создан BMJ Publishing Group из электронного файл, предоставленный автором (авторами) и не подвергавшийся редактированию.

  • Дополнение к данным 1
  • Дополнение к данным 2
  • Дополнение к данным 3
  • Дополнение к данным 4
  • Дополнение к данным 5
  • Дополнение к данным 6
  • Дополнение к данным 7
  • Дополнение к данным 8
  • Дополнение к данным 9
  • Дополнение к данным 10

Сноски

• Участники Концептуализация: EO, DB, AG, DM, FF и JS. Методология: EO, DB, AG, SG, GN, DM, FF и JS. Валидация: KL, AE и KK. Формальный анализ: EO, DB, KL, AE и JS. Ресурсы: GN, DM, FF и JS. Курирование данных: EO, DB, AG, NB, DL, AL, AB, VK, AE, KK и SG. Написание, подготовка первоначального проекта: EO, AG и JS. Написание, рецензирование и редактирование: DM и FF. Визуализация: БД, АГ и НБ. Надзор: DM, FF и JS. Администрация проекта: JS. Получение финансирования: DM, FF и JS. Гарант: JS

• Финансирование Это исследование финансировалось Министерством образования и исследований Германии (BMBF; разрешение № 031B0006A-C).

• Конкурирующие интересы Не заявлено.

• Происхождение и рецензирование Не введен в эксплуатацию; рецензируется внешними экспертами.

• Дополнительный материал Содержание предоставлено автором(ами). Он не был проверен BMJ Publishing Group Limited (BMJ) и, возможно, не прошел рецензирование. Любые обсуждаемые мнения или рекомендации принадлежат исключительно авторам и не поддерживаются BMJ.